Проведение четырех анализов амплификации нуклеиновых кислот для выявления SARS-CoV-2 в Эфиопии

Спасибо за посещение Nature.com. Вы используете версию браузера с ограниченной поддержкой CSS. Для наилучшего опыта мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). Кроме того, для обеспечения постоянной поддержки мы показываем сайт без стилей и JavaScript.
Отображает карусель из трех слайдов одновременно. Используйте кнопки «Предыдущий» и «Следующий», чтобы перемещаться по трем слайдам одновременно, или используйте кнопки слайдера в конце, чтобы перемещаться по трем слайдам одновременно.
После вспышки коронавирусной болезни 2019 года (COVID-19) по всему миру было разработано множество коммерческих тестов амплификации нуклеиновых кислот (NAAT), которые стали стандартными анализами. Хотя несколько тестов были быстро разработаны и применены для лабораторных диагностических тестов, эффективность этих тестов не была оценена в различных условиях. Поэтому данное исследование было направлено на оценку эффективности анализов Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI и Sansure Biotech с использованием Композитного эталонного стандарта (CRS). Исследование проводилось в Эфиопском институте общественного здравоохранения (EPHI) с 1 по 30 декабря 2020 года. Было взято 164 образца из носоглотки с использованием мини-набора QIAamp RNA и системы подготовки образцов Abbott DNA. Из 164 образцов 59,1% были положительными и 40,9% были отрицательными для CRS. Положительный результат теста Sansure Biotech был значительно ниже по сравнению с CRS (p < 0,05). Положительный результат теста Sansure Biotech был значительно ниже по сравнению с CRS (p < 0,05). Положительные результаты Sansure Biotech были значительно ниже по сравнению с CRS (p < 0,05). Положительные результаты Sansure Biotech были значительно ниже по сравнению с CRS (p < 0,05).与CRS 相比, Sansure Biotech 的阳性率显着较低 (p < 0,05).与CRS 相比, Sansure Biotech 的阳性率显着较低 (p < 0,05). У Sansure Biotech было значительно меньше результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). У Sansure Biotech было значительно меньше положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05).Общее согласие четырех анализов составило 96,3–100% по сравнению с CRS. Помимо низкого уровня позитивности анализа Sansure Biotech, производительность четырех анализов была почти сопоставимой. Таким образом, анализ Sansure Biotech [Research Only (RUO)] требует дополнительной проверки для использования в Эфиопии. Наконец, следует рассмотреть возможность дополнительных исследований для оценки анализов с соответствующими заявлениями производителя.
Лабораторное тестирование является частью Стратегического плана Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) по готовности и реагированию на коронавирусную болезнь 2019 (COVID-19) (SPRP). ВОЗ рекомендует странам наращивать лабораторный потенциал для повышения готовности, надлежащего ведения случаев, бдительности и быстрого реагирования на проблемы общественного здравоохранения. Это говорит о том, что роль лаборатории является ключевой для характеристики заболевания и эпидемиологии новых инфекционных агентов и контроля их распространения.
Для диагностики COVID-19 требуются эпидемиологическая и медицинская информация, личные симптомы/признаки, а также рентгенологические и лабораторные данные2. С тех пор, как вспышка COVID-19 была зарегистрирована в Ухане, Китай, по всему миру было разработано множество коммерческих тестов амплификации нуклеиновых кислот (NAAT). Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в реальном времени (rRT-PCR) использовалась в качестве рутинного и стандартного метода лабораторной диагностики инфекции тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2)3. Молекулярное обнаружение SARS-CoV-2 обычно основано на генах N (ген белка нуклеокапсида), E (ген белка оболочки) и RdRp (ген РНК-зависимой РНК-полимеразы) в области ORF1a/b (открытая рамка считывания 1a/b), идентифицированной из вирусного генома. Они считаются основными консервативными областями, обнаруженными в вирусных геномах для распознавания вируса4. Среди этих генов гены RdRp и E имеют высокую аналитическую чувствительность обнаружения, тогда как ген N имеет низкую аналитическую чувствительность5.
Эффективность ПЦР-анализов может варьироваться в зависимости от различных факторов, таких как: реагенты для экстракции, реагенты для амплификации/обнаружения, метод экстракции, качество ПЦР-аппарата и других инструментов. По состоянию на апрель 2020 года более 48 различных диагностических устройств из девяти стран получили разрешение на экстренное использование (EUA) для диагностики COVID-196. В Эфиопии для ПЦР-обнаружения SARS-CoV-2 с помощью ПЦР используется более 14 платформ ПЦР в реальном времени в 26 учреждениях общественного здравоохранения, включая ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 и Quant-studio7. Кроме того, доступны различные наборы для ПЦР-тестов, такие как тест Daan Gene, тест Abbott SARS-CoV-2, тест Sansure Biotech и тест SARS-CoV-2 BGI. Хотя rRT-PCR очень чувствителен, некоторые пациенты с COVID-19 сообщают о ложноотрицательных результатах из-за недостаточного количества копий вирусной рибонуклеиновой кислоты (РНК) в образцах из-за неправильного сбора, транспортировки, хранения и обращения, а также лабораторного тестирования. условий и действий персонала8. Кроме того, неправильное обращение с образцами или контролями, установка порога цикла (Ct) и перекрестная реактивность с другими патогенными нуклеиновыми кислотами или неактивной/остаточной РНК SARS-CoV-2 могут привести к ложноположительным результатам в анализах rRT-PCR9. Таким образом, очевидно, что тесты ПЦР действительно могут идентифицировать носителей фрагментов генов, поскольку они даже не могут различать действительно активные вирусные гены, поэтому тесты могут идентифицировать только носителей, а не пациентов10. Поэтому важно оценивать диагностическую эффективность с использованием стандартных методов в наших условиях. Хотя многие реагенты NAAT доступны в Эфиопском институте общественного здравоохранения (EPHI) и по всей стране, сравнительной оценки их эффективности пока не проводилось. Таким образом, целью данного исследования была сравнительная оценка эффективности имеющихся в продаже наборов для обнаружения SARS-CoV-2 методом ОТ-ПЦР с использованием клинических образцов.
В исследование было включено 164 участника с подозрением на COVID-19. Большинство образцов были взяты из лечебных центров (118/164 = 72%), а остальные 46 (28%) участников были взяты из нелечебных центров. Среди участников, не проходивших лечение в центре, у 15 (9,1%) были клинически подозреваемые случаи, а у 31 (18,9%) были контакты с подтвержденными случаями. Девяносто три (56,7%) участника были мужчинами, а средний (± SD) возраст участников составил 31,10 (± 11,82) года.
В этом исследовании были определены положительные и отрицательные показатели четырех тестов на COVID-19. Таким образом, положительные показатели анализа Abbott SARS-CoV-2, анализа Daan Gene 2019-nCoV, анализа SARS-CoV-2 BGI и анализа Sansure Biotech 2019-nCoV составили 59,1%, 58,5%, 57,9% и 55,5% соответственно. Положительные и отрицательные баллы композитного референтного стандарта (CRS) составили 97 (59,1%) и 67 (40,9%) соответственно (таблица 1). В этом исследовании определение CRS основывалось на правиле «любой положительный», согласно которому из четырех результатов теста два или более результатов теста, давших одинаковый результат, считались истинно положительными или отрицательными.
В этом исследовании мы обнаружили отрицательное процентное согласие (NPA) 100% (95% ДИ 94,6–100) для всех анализов по сравнению с CRS. Анализ Sansure Biotechnology показал минимальное PPA 93,8% (95% ДИ 87,2–97,1), а анализ Daan Gene 2019-nCoV имел общее согласие 99,4% (95% ДИ 96,6–99,9). Напротив, общее согласие между анализом SARS-CoV-2 BGI и анализом Sansure Biotech 2019-nCoV составило 98,8% и 96,3% соответственно (таблица 2).
Коэффициент согласия каппа Коэна между результатами анализа CRS и Abbott SARS-CoV-2 полностью соответствовал (K = 1,00). Аналогично, значения каппа Коэна, обнаруженные Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI и Sansure Biotech 2019-nCoV, также полностью соответствуют CRS (K ≥ 0,925). В этом сравнительном анализе тест хи-квадрат (тест Макнемара) показал, что результаты анализа Sansure Biotech 2019-nCoV значительно отличались от результатов CRS (p = 0,031) (таблица 2).
Как показано на рис.1 процент самого низкого значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало, что процент низкого значения Ct (< 20 Ct) составил 50,3%, а высокого значения Ct (36–40 Ct) составил 3,2%. 1 процент самого низкого значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало, что процент низкого значения Ct (< 20 Ct) составил 50,3%, а высокого значения Ct (36–40 Ct) составил 3,2%.Как показано на рис.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6%, значение Ct гена ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало, что процентное значение Ct (< 20 Ct) составило 50,3%, хорошее значение Ct (36–40 Ct) 3,2%. 1, процент самого низкого значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6%, а значение Ct анализа гена ORF1a/b Sansure Biotech 2019-nCoV показал, что процент низкого значения Ct (< 20 Ct) составил 50,3%, а высокого значения Ct (36–40 Ct) – 3,2%.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（< 20 Ct）为87,6%, Sansure Biotech 2019-nCoV ≥ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%，高Ct 值(36–40 Ct)的百分比为3,2%. Как показано на рисунке 1, самый низкий процент значений Ct (< 20 Ct) теста Abbott SARS-CoV-2 (комбинация генов RdRp и N) составляет 87,6%, значение Ct гена ORF1a/b теста Sansure Biotech 2019-nCoV показывает низкий процент Ct值(< 20 Ct) 的 составляет 50,3%, процент Ct值(36–40 Ct) 的 составляет 3,2%. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (сочетающий гены RdRp и N) имел самое низкое процентное значение Ct (< 20 Ct) в среднем 87,6%, значение Ct гена ORF1a/b в процессе Sansure Biotech 2019. Анализ nCoV показал низкий Ct. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (объединяющий гены RdRp и N) показал самое низкое процентное значение Ct (< 20 Ct) — 87,6%, в то время как значение Ct гена ORF1a/b в исследовании Sansure Biotech 2019 — анализ nCoV показал низкое значение Ct. Процент оценок (< 20 Ct) составил 50,3%, а процент высоких результатов Ct (36–40 Ct) составил 3,2%. Процент значений (< 20 Ct) составил 50,3%, а процент высоких значений Ct (36–40 Ct) составил 3,2%.Тест Abbott SARS-CoV-2 B зафиксировал значения Ct выше 30. С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), процент составил 4% (рис. 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), процент составил 4% (рис. 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (>36 Ct), процент которого составлял 4% (рис. 1). С другой стороны, при анализе BGI ген ORF1a/b SARS-CoV-2 имел высокое значение Ct (> 36 Ct), процент которого составил 4% (рис. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比为4%（图1). С другой стороны, при обнаружении BGI SARS-CoV-2 процент гена ORF1a/b с высоким значением Ct (>36 Ct) составляет 4% (рисунок 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 процент генов ORF1a/b с переменными значениями Ct (>36 Ct) составил 4% (рис. 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 процент генов ORF1a/b с высокими значениями Ct (>36 Ct) составил 4% (рис. 1).
В этом исследовании мы взяли 164 образца из носоглотки. Для всех типов анализов выделение и амплификация РНК проводились с использованием методов и наборов, рекомендованных соответствующими производителями.
Это исследование продемонстрировало, что тест Abbott для SARS-CoV-2 имеет ту же эффективность обнаружения, что и CRS, со 100% положительным, отрицательным и общим соответствием. Согласие каппа Коэна составляет 1,00, что указывает на полное согласие с CRS. Аналогичное исследование, проведенное Вашингтонским университетом в США, показало, что общая чувствительность и специфичность теста Abbott для SARS-CoV-2 составила 93% и 100% соответственно по сравнению с лабораторно определяемым анализом (LDA) CDC. 11. Система обнаружения Abbott SARS-CoV-2 основана на одновременном комбинированном обнаружении генов N и RdRp, поскольку оба гена более чувствительны, что сводит к минимуму ложноотрицательные результаты12. Исследование, проведенное в Вене, Австрия, также показало, что большие объемы образцов для экстракции и объемы элюента для обнаружения минимизируют эффекты разбавления и повышают эффективность обнаружения13. Таким образом, идеальное соответствие Abbott для анализа SARS-CoV-2 может быть связано с платформенной системой обнаружения, которая одновременно обнаруживает комбинаторные гены, извлекает большое количество образцов (0,5 мл) и использует большой объем элюента (40 мкл).
Наши результаты также показали, что эффективность обнаружения генетического теста Daan была почти такой же, как и у CRS. Это согласуется с исследованием14, проведенным в Университете Аньхой в Хуайнане, Китай, и заявлением производителя о 100% положительном согласии. Несмотря на сообщения о последовательных результатах, один образец оказался ложноотрицательным после повторного тестирования того же элюата, но был положительным в анализах Abbott SARS-CoV-2 и Sansure Biotech nCoV-2019. Это говорит о том, что может быть изменчивость результатов в разных типах анализов. Тем не менее, в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значительно отличался (p < 0,05) по сравнению с их референтным анализом, определенным в лаборатории. Тем не менее, в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значительно отличался (p < 0,05) по сравнению с их референтным анализом, определенным в лаборатории. Тем не менее, в ходе исследования, проведенного в Китае15, результаты анализа Даана Джина значительно отличались (p < 0,05) от их лабораторного эталонного анализа. Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значительно отличался (p < 0,05) от их лабораторного контрольного анализа.然而,在中国进行的研究中15,大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p < 0,05）。然而,在中国进行的研究中15,大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Даана значительно отличались (p < 0,05) по сравнению с его эталонным лабораторным тестом. Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Даана значительно отличались (p < 0,05) от его референтного лабораторного теста.Это расхождение может быть связано с чувствительностью эталонного теста для выявления SARS-CoV-2, и для определения причины могут потребоваться дальнейшие исследования.
Кроме того, наше исследование оценило сравнительную эффективность анализа SARS-CoV-2 BGI с CRS, показав превосходное положительное процентное согласие (PPA = 97,9%), отрицательное процентное согласие (NPA = 100%) и общее процентное согласие по полу (OPA). ). = 98,8%). Значения каппа Коэна показали хорошее согласие (K = 0,975). Исследования в Нидерландах16 и Китае15 показали последовательные результаты. Тест SARS-CoV-2 BGI представляет собой тест обнаружения одного гена (ORF1a/b) с использованием 10 мкл элюата амплификации/обнаружения. Несмотря на хорошее статистическое согласие с нашими референтными результатами, анализ пропустил два положительных образца (1,22%) из общей выборки. Это может иметь огромные клинические последствия для динамики передачи как на уровне пациента, так и на уровне сообщества.
Другим сравнительным анализом, включенным в это исследование, был анализ Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO); общий процент совпадения составил 96,3%. Сила согласия также определялась значением каппа Коэна, которое составило 0,925, что указывает на полное согласие с CRS. Опять же, наши результаты идентичны исследованиям, проведенным в Центральном южном университете в Чанше, Китай, и в клиническом лабораторном отделении Народной больницы Лючжоу, город Лючжоу, Китай17. Несмотря на то, что было зафиксировано хорошее статистическое соответствие, тест хи-квадрат (тест Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имел статистически значимое отличие по сравнению с CRS (p < 0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано хорошее статистическое соответствие, тест хи-квадрат (тест Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имел статистически значимое отличие по сравнению с CRS (p < 0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеет статистические сравнения по сравнению с CRS (p < 0,005). Хотя выше было зафиксировано хорошее статистическое согласие, тест хи-квадрат (тест Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имел статистически значимое отличие по сравнению с CRS (p < 0,005).Компания Sansure Biotech, компания Sansure Biotech, компания CRS相比具有统计学显着差异 (p < 0,005).尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （(macnemar 检验 表明 ， , sansure biotech 检测 结果与 crs 相比 具有 显着 （（p <0,005。。。。。。。。。。。。。。。。。。。）））） Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал статистическую значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech и CRS. Несмотря на хорошее статистическое согласие, отмеченное выше, тест хи-квадрат (тест Макнемара) показал статистически значимое различие (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech и CRS.Шесть образцов (3,66%) оказались ложноотрицательными по сравнению с CRS (Дополнительная таблица 1); это очень важно, особенно учитывая динамику передачи вируса. Приведенные выше данные также подтверждают этот низкий уровень обнаружения15.
В этом исследовании значения Ct были определены для каждого анализа и соответствующей платформы, при этом наименьшее среднее значение Ct было зарегистрировано в анализе Abbott SARS-CoV-2. Этот результат может быть связан с одновременной комбинированной системой генетического тестирования Abbott для обнаружения SARS-CoV-2. Таким образом, согласно рисунку 1, 87,6% результатов Abbott SARS-CoV-2 имели значения Ct ниже 20. Только небольшое количество результатов образцов (12,4%) находились в диапазоне 20-30. Значения Ct выше 30 не были зарегистрированы. Помимо использования Abbott формата генетического тестирования панели SARS-CoV-2, этот результат может быть связан с нижним пределом обнаружения (32,5 копий РНК/мл)18, что в три раза ниже нижнего предела компании в 100 копий РНК/мл. мл)19.
Это исследование имеет некоторые ограничения: во-первых, у нас нет стандартных/референтных методов [таких как вирусная нагрузка или другие лабораторные тесты (LDA)] из-за нехватки ресурсов. Во-вторых, все образцы, использованные в этом исследовании, были мазками из носоглотки, в то время как результаты не были применимы к другим типам образцов, и, в-третьих, размер нашей выборки был небольшим.
В этом исследовании сравнивалась эффективность четырех анализов rRT-PCR для SARS-CoV-2 с использованием образцов из носоглотки. Все анализы обнаружения имели почти сопоставимую эффективность, за исключением анализа Sansure Biotech. Кроме того, низкий уровень позитивности был выявлен в анализе Sansure Biotech по сравнению с CRS (p < 0,05). Кроме того, низкий уровень позитивности был выявлен в анализе Sansure Biotech по сравнению с CRS (p < 0,05). Кроме того, в тесте Sansure Biotech был выявлен низкий процент результатов по сравнению с СВК (p < 0,05). Кроме того, тест Sansure Biotech показал низкий процент положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05).Компания Sansure Biotech разработала CRS (p < 0,05).Компания Sansure Biotech разработала CRS (p < 0,05). Кроме того, анализ Sansure Biotech имел более низкий уровень результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Кроме того, анализ Sansure Biotech имел более низкий уровень положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05).Анализ Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) PPA, NPA и общего согласия превысил 93,5% с силой согласия Коэна Каппа 0,925. Наконец, анализ Sansure Biotech (RUO) нуждается в дальнейшей проверке для использования в Эфиопии, и следует рассмотреть дополнительные исследования для оценки заявлений отдельных производителей.
Сравнительный дизайн исследования проводился в четырех медицинских учреждениях в Аддис-Абебе, больнице Эка Котебе, лечебном центре церкви Миллениум, мемориальной больнице Зевудиту и специализированной больнице по туберкулезу Св. Петра. Данные собирались в период с 1 по 31 декабря 2020 года. Медицинские учреждения для этого исследования были намеренно выбраны с учетом большого количества случаев и наличия в городе крупных лечебных центров. Аналогичным образом, приборы, включая приборы ПЦР в реальном времени ABI 7500 и Abbott m2000, были выбраны в соответствии с рекомендациями производителей реагентов NAAT, и для этого исследования были выбраны четыре набора для обнаружения ПЦР, поскольку большинство лабораторий в Эфиопии использовали по крайней мере четыре из них. Тест Gene, тест Abbott SARS-CoV-2, тест Sansure Biotech и тест SARS-CoV-2 BGI, проведенные во время исследования).
Тестирование на SARS-CoV-2 проводилось с 1 по 30 декабря 2020 года с использованием 3 мл вирусной транспортной среды (VTM) (Miraclean Technology, Шэньчжэнь, Китай) у лиц, находящихся под следствием по COVID-19, направленных в EPHI. Образцы из носоглотки собирались обученными сборщиками образцов и отправлялись в EPHI в тройных упаковках. Перед выделением нуклеиновой кислоты каждому образцу присваивается уникальный идентификационный номер. Извлечение выполняется из каждого образца сразу по прибытии с использованием ручных и автоматических методов извлечения. Таким образом, для автоматического извлечения Abbott m2000 1,3 мл (включая 0,8 мл мертвого объема и 0,5 мл входного объема для извлечения) образца извлекалось из каждого образца и пропускалось через систему подготовки образцов ДНК Abbott (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, США). ) Партия из 96 [92 образцов, два контроля обнаружения и два нешаблонных контроля (NTC)] была включена в общий процесс (извлечение и обнаружение) двух раундов SARS-CoV-2 (EUA) в режиме реального времени. майнинг. Аналогично, для ручной экстракции используйте те же образцы (для автоматической экстракции и обнаружения). Таким образом, на протяжении всего процесса образцы объемом 140 мкл были аликвотированы и извлечены с использованием набора QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Хильден, Германия) партиями по 24 (включая 20 образцов, два контроля анализа и два NTC) в течение девяти раундов. Извлеченные вручную элюаты были амплифицированы и обнаружены с использованием термоциклера ABI 7500 с использованием анализа SARS-CoV-2 BGI, анализа Daan Gene и анализа Sansure Biotech.
Автоматизированное выделение и очистка вирусной РНК SARS-CoV-2 следует принципу магнитных шариков с использованием реагентов для подготовки образцов ДНК Abbott. Инактивация образцов и солюбилизация вирусных частиц проводятся с использованием детергента, содержащего гуанидинизотиоцианат, для денатурации белка и инактивации РНКазы. Затем РНК отделяется от белка путем твердофазного разделения с использованием кремнезема, т. е. соль гуанидиния и щелочной pH буфера лизиса способствуют связыванию нуклеиновых кислот с кремнеземом (SiO2). Этап промывки удаляет оставшиеся белки и дебрис, получая прозрачный раствор. Прозрачная РНК выделяется из микрочастиц на основе кремнезема с использованием магнитного поля прибора20,21. С другой стороны, ручное выделение и очистка РНК проводятся методом спин-колонки с использованием центрифугирования вместо магнитного стенда и отделения микрочастиц от элюента.
Тест на обнаружение SARS-CoV-2 в реальном времени Abbott (Abbott Molecular, Inc.) был выполнен в соответствии с инструкциями производителя, который получил EUA19,22 от ВОЗ и FDA. В этом протоколе инактивация образца перед экстракцией проводилась на водяной бане при температуре 56 °C в течение 30 мин. После инактивации вируса экстракция нуклеиновой кислоты проводилась на приборе Abbott m2000 SP из 0,5 мл VTM с использованием системы подготовки образцов ДНК Abbott m2000. в соответствии с данными производителя. Амплификация и детекция проводились с использованием прибора Abbott m2000 RT-PCR, а двойная детекция проводилась для генов RdRp и N. ROX) и VIC P (запатентованный краситель) для нацеливания и обнаружения внутренних контролей, что позволяет одновременно обнаруживать оба продукта амплификации 19 .
Метод обнаружения амплификации этого набора основан на одношаговой технологии ОТ-ПЦР. Гены ORF1a/b и N были выбраны в качестве консервативных областей компанией Daan Gene Technology для обнаружения амплификации целевой области. Специфические праймеры и флуоресцентные зонды (зонды гена N, маркированные FAM, зонды ORF1a/b, маркированные VIC) были разработаны для обнаружения РНК SARS-CoV-2 в образцах. Окончательный элюент и мастер-смеси были приготовлены путем добавления 5 мкл элюента к 20 мкл мастер-смеси до конечного объема 25 мкл. Амплификацию и обнаружение проводили одновременно на приборе ПЦР в реальном времени ABI 750024.
Гены ORF1a/b и N были обнаружены с помощью набора для диагностики нуклеиновых кислот nCoV-2019 Sansure Biotech (флуоресцентная ПЦР-детекция). Подготовьте специфические зонды для каждого целевого гена, выбрав канал FAM для области ORF1a/b и канал ROX для гена N. К этому набору для анализа добавляются элюент и реагенты мастер-микс следующим образом: подготовьте 30 мкл реагента мастер-микс и 20 мкл элюированного образца для обнаружения/амплификации. Для амплификации/детекции использовался ПЦР в реальном времени ABI 750025.
Тест SARS-CoV-2 BGI представляет собой набор для флуоресцентной ОТ-ПЦР в реальном времени для диагностики COVID-19. Целевая область расположена в области ORF1a/b генома SARS-CoV-2, что является методом обнаружения одного гена. Кроме того, ген домашнего хозяйства человека β-актин является внутренне регулируемым целевым геном. Мастер-микс готовят путем смешивания 20 мкл реагента мастер-микса и 10 мкл извлеченного образца РНК в луночном планшете26. Для амплификации и обнаружения использовали флуоресцентный количественный прибор для ПЦР в реальном времени ABI 7500. Все амплификации нуклеиновых кислот, условия проведения ПЦР для каждого анализа и интерпретация результатов выполнялись в соответствии с инструкциями соответствующего производителя (таблица 3).
В этом сравнительном анализе мы не использовали метод эталонного стандарта для определения процента согласия (положительного, отрицательного и общего) и других параметров сравнения для четырех анализов. Каждое сравнение тестов проводилось с помощью CRS, в этом исследовании CRS устанавливался по правилу «любой положительный», и результат определялся не одним тестом, мы использовали по крайней мере два совпадающих результата теста. Кроме того, в случае передачи COVID-19 ложноотрицательные результаты более опасны, чем ложноположительные результаты. Поэтому, чтобы сказать «положительный» как можно точнее по результату CRS, по крайней мере два теста анализа должны быть положительными, что означает, что по крайней мере один положительный результат, вероятно, будет получен из анализа EUA. Таким образом, из четырех результатов теста два или более результатов теста, которые дают одинаковый результат, считаются истинно положительными или отрицательными18,27.
Данные собирались с использованием структурированных форм извлечения данных, ввод данных и анализ выполнялись с использованием статистического программного обеспечения Excel и SPSS версии 23.0 для описательной статистики. Анализировались положительные, отрицательные и общие процентные значения согласия, а для определения степени согласия каждого метода с CRS использовалась оценка Каппа. Значения Каппа интерпретируются следующим образом: от 0,01 до 0,20 для слабого согласия, от 0,21 до 0,40 для общего согласия, от 0,41 до 0,60 для умеренного согласия, от 0,61 до 0,80 для значительного согласия и от 0,81 до 0,99 для полного согласия28.
Этическое разрешение было получено от Университета Аддис-Абебы, и все экспериментальные протоколы для этого исследования были одобрены Советом по рассмотрению научной этики Эфиопского института общественного здравоохранения. Номер ссылки для лицензии на этику EPHI — EPHI/IRB-279-2020. Все методы применялись в соответствии с рекомендациями и положениями Эфиопских национальных комплексных руководств по лечению COVID-19. Кроме того, от всех участников исследования было получено письменное информированное согласие до участия в исследовании.
Все данные, полученные или проанализированные в этом исследовании, включены в эту опубликованную статью. Данные, подтверждающие результаты этого исследования, доступны у соответствующего автора по обоснованному запросу.
Всемирная организация здравоохранения. Рекомендации по стратегиям лабораторного тестирования на COVID-19: Временное руководство, 21 марта 2020 г. № WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (ВОЗ, 2020).
Мулиу, Д.С., Пантазопулос, И. и Гургулианис, К.И. Интеллектуальная диагностика COVID-19 в отделении неотложной помощи: комплексное решение на практике. Мулиу, Д.С., Пантазопулос, И. и Гургулианис, К.И. Интеллектуальная диагностика COVID-19 в отделении неотложной помощи: комплексное решение на практике.Мулиу, Д.С., Пантазопулос, И. и Гургулианис, К.И. Интеллектуальная диагностика COVID-19 в отделении неотложной помощи: все на практике.Мулиу Д.С., Пантазопулос И. и Гургулянис К.И. Интеллектуальная диагностика COVID-19 в отделениях неотложной помощи: сквозная интеграция на практике. Эксперт преподобный Респир. медицина. 3, 263–272 (2022).
Митчелл, С.Л. и Сент-Джордж, К. Оценка теста COVID19 ID NOW EUA. Митчелл, С.Л. и Сент-Джордж, К. Оценка теста COVID19 ID NOW EUA.Митчелл, С.Л. и Сент-Джордж, К. Оценка теста COVID19 ID NOW EUA.Митчелл С.Л. и Сент-Джордж К. Оценка анализа COVID19 ID NOW EUA. J. Clinical. Virus. 128, 104429. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
ВОЗ. Лабораторное выявление коронавирусной инфекции 2019 года (COVID-19) у людей с подозрением на заболевание. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (дата обращения: 15 августа 2020 г.) (ВОЗ, 2020 г.).
Удугама, Б. и др. Диагностика COVID-19: заболевания и инструменты тестирования. ACS Nano 14(4), 3822–3835 (2020).
Сайед С. и др. Создание Коллегии патологов Восточной, Центральной и Южной Африки – Региональной школы патологии Ближнего Востока и Южной Африки. Африка. J. Lab. medicine. 9(1), 1-8 (2020).
Эфиопский институт общественного здравоохранения, Федеральное министерство здравоохранения. Временная национальная стратегия и руководство по лабораторной диагностике COVID-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (дата обращения: 12 августа 2020 г.) (EPHI, 2020 г.).
Волошин, С., Патель, Н. и Кессельхайм, А.С. Ложноотрицательные тесты на инфекцию SARS-CoV-2: проблемы и последствия. Волошин, С., Патель, Н. и Кессельхайм, А.С. Ложноотрицательные тесты на инфекцию SARS-CoV-2: проблемы и последствия.Волошин С., Патель Н. и Кессельхайм А.С. Ложноотрицательные результаты тестов на инфекции SARS-CoV-2 и их последствия.Волошин С., Патель Н. и Кессельхайм А.С. Ложноотрицательные тесты на провокацию и влияние инфекции SARS-CoV-2. N. eng. J. Medicine. 383(6), e38 (2020).
Мулиу, Д.С. и Гургулианис, К.И. Ложноположительные и ложноотрицательные случаи COVID-19: стратегии профилактики и лечения респираторных заболеваний, вакцинация и дальнейшие перспективы. Мулиу, Д.С. и Гургулианис, К.И. Ложноположительные и ложноотрицательные случаи COVID-19: стратегии профилактики и лечения респираторных заболеваний, вакцинация и дальнейшие перспективы. Мулиу, Д.С. и Гургульянис, К.И. Ложноположительные и ложноотрицательные случаи COVID-19: респираторная профилактика и стратегия лечения, вакцинация и дальнейшие перспективы. Мулиу, Д.С. и Гургулианис, К.И. Ложноположительные и ложноотрицательные случаи COVID-19: стратегии профилактики и лечения респираторных заболеваний, вакцинация и дальнейшие шаги.Мулиу, Д.С. и Гургулианис, К.И. Ложноположительные и ложноотрицательные случаи COVID-19: стратегии респираторной профилактики и лечения, вакцинации и пути вперед. Эксперт преподобный Респир. медицина. 15(8), 993–1002 (2021).
Мулиу, Д.С., Иоаннис, П. и Константинос, Г. Диагностика COVID-19 в отделении неотложной помощи: видим дерево, но теряем лес. Мулиу, Д.С., Иоаннис, П. и Константинос, Г. Диагностика COVID-19 в отделении неотложной помощи: видим дерево, но теряем лес.Мулиу, Д.С., Иоаннис, П. и Константинос, Г. Диагностика COVID-19 в отделении неотложной помощи: увидеть дерево, потерять лес.Мулиу Д.С., Иоаннис П. и Константинос Г. Диагностика COVID-19 в отделениях неотложной помощи: недостаточно леса для деревьев. Appear. medicine. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. et al. Валидация и проверка аналитической и клинической эффективности теста Abbott RealTime SARS-CoV-2. J. Clinical. Virus. 129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Моллаеи, Х.Р., Афшар, А.А., Калантар-Нейестанаки, Д., Фазлалипур, М. и Афлатуниан, Б. Сравнение пяти наборов праймеров из разных областей генома COVID-19 для обнаружения вирусной инфекции с помощью традиционной ОТ-ПЦР. Моллаеи, Х.Р., Афшар, А.А., Калантар-Нейестанаки, Д., Фазлалипур, М. и Афлатуниан, Б. Сравнение пяти наборов праймеров из разных областей генома COVID-19 для обнаружения вирусной инфекции с помощью традиционной ОТ-ПЦР.Моллаеи, Х.Р., Афшар, А.А., Калантар-Нейестанаки, Д., Фазлалипур, М. и Афлатунян, Б. Сравнение пяти наборов праймеров из разных регионов генома COVID-19 для обнаружения вирусной инфекции с помощью традиционной ОТ-ПЦР. Моллаи, Х.Р., Афшар, А.А., Калантар-Неестанаки, Д., Фазлалипур, М. и Афлатунян, Б. 比较来自COVID-19不同基因组区域的五个引物组, RT-PCR 检测病毒感染。 Моллаеи, Х.Р., Афшар, А.А., Калантар-Нейестанаки, Д., Фазлалипур, М. и Афлатуниан, Б. Сравнение 5 различных генетических регионов COVID-19 для обнаружения вирусной инфекции с помощью традиционной ОТ-ПЦР.Моллаеи Х.Р., Афшар А.А., Калантар-Нейестанаки Д., Фазлалипур М. и Афлатунян Б. Сравнение пяти наборов праймеров из разных регионов генома COVID-19 для обнаружения вирусной инфекции с помощью традиционной ОТ-ПЦР.Иран. Журнал микробиологии. 12(3), 185 (2020).
Герцер, И. и др. Предварительные результаты национальной программы внешней оценки качества для обнаружения последовательностей генома SARS-CoV-2. J. Clinical. Virus. 129, 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Ван, М. и др. Аналитическая оценка эффективности пяти наборов ОТ-ПЦР для тяжелого острого респираторного синдрома, коронавируса 2. J. Clinical. Laboratory. Anus. 35(1), e23643 (2021).
Ван Б. и др. Оценка семи коммерчески доступных наборов для обнаружения РНК SARS-CoV-2 в Китае на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. клиническая. химическая. лабораторная. медицина. 58(9), e149–e153 (2020).
ван Кастерен, ПБ и др. Сравнение семи коммерческих диагностических наборов ОТ-ПЦР COVID-19. J. Clinical. Virus. 128, 104412 (2020).
Лу, Ю и др. Сравнение диагностической эффективности двух наборов ПЦР для обнаружения нуклеиновых кислот SARS-CoV-2. J. Clinical. Laboratory. Anus. 34(10), e23554 (2020).
Lefart, PR и др. Сравнительное исследование четырех платформ тестирования амплификации нуклеиновых кислот (NAAT) SARS-CoV-2 показало, что производительность ID NOW значительно ухудшалась в зависимости от пациента и типа образца. диагностика. микробиология. Инфекция. дисс. 99(1), 115200 (2021).
Молекула Abbott. Вкладыш в упаковку анализа SARS-CoV-2 в реальном времени Abbott. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay. 1-12. (По состоянию на 10 августа 2020 г.) (2020).
Кляйн, С. и др. Выделение РНК SARS-CoV-2 с использованием магнитных шариков для быстрого крупномасштабного обнаружения с помощью ОТ-ПЦР и ОТ-ЛАМП. Вирус 12(8), 863 (2020).