Проведение четырех анализов амплификации нуклеиновых кислот для выявления SARS-CoV-2 в Эфиопии

Благодарим вас за посещение Nature.com. Вы используете версию браузера с ограниченной поддержкой CSS. Для оптимальной работы мы рекомендуем использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). Кроме того, для обеспечения постоянной поддержки мы показываем сайт без стилей и JavaScript.
Отображает карусель из трех слайдов одновременно. Используйте кнопки «Предыдущий» и «Далее» для перемещения по трем слайдам одновременно или используйте кнопки ползунка в конце для перемещения по трем слайдам одновременно.
После вспышки коронавирусной болезни (COVID-19) в 2019 году во всем мире было разработано множество коммерческих тестов амплификации нуклеиновых кислот (МАНК), которые стали стандартными анализами. Хотя несколько тестов были быстро разработаны и применены к лабораторным диагностическим тестам, эффективность этих тестов не оценивалась в различных условиях. Таким образом, целью данного исследования было оценить эффективность анализов Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI и Sansure Biotech с использованием композитного эталонного стандарта (CRS). Исследование проводилось в Эфиопском институте общественного здравоохранения (EPHI) с 1 по 30 декабря 2020 года. С помощью мини-набора QIAamp RNA и системы подготовки образцов ДНК Abbott было выделено 164 образца из носоглотки. Из 164 образцов 59,1% были положительными и 40,9% были отрицательными на СВК. Положительный результат Sansure Biotech был значительно ниже по сравнению с CRS (p <0,05). Положительный результат Sansure Biotech был значительно ниже по сравнению с CRS (p <0,05). Положительные результаты Sansure Biotech были значительно ниже по сравнению с CRS (p < 0,05). Положительные результаты Sansure Biotech были значительно ниже по сравнению с CRS (p <0,05).与CRS 相比, Sansure Biotech 的阳性率显着较低 (p < 0,05).与CRS 相比, Sansure Biotech 的阳性率显着较低 (p < 0,05). У Sansure Biotech было значительно меньше результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Sansure Biotech имела значительно меньше положительных результатов по сравнению с CRS (p <0,05).Общее согласие четырех анализов составило 96,3–100% по сравнению с СВК. Помимо низкого уровня положительных результатов анализа Sansure Biotech, эффективность четырех анализов была почти сопоставимой. Таким образом, анализ Sansure Biotech [Research Only (RUO)] требует дополнительной проверки для его использования в Эфиопии. Наконец, следует рассмотреть возможность проведения дополнительных исследований для оценки анализов, соответствующих заявлениям производителя.
Лабораторные испытания являются частью Стратегического плана Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) по обеспечению готовности и реагированию на коронавирусное заболевание на 2019 год (COVID-19). ВОЗ рекомендует странам создать лабораторный потенциал для повышения готовности, надлежащего ведения случаев, бдительности и быстрого реагирования на проблемы общественного здравоохранения. Это говорит о том, что роль лаборатории является ключевой для характеристики заболевания и эпидемиологии новых инфекционных агентов и контроля их распространения.
Для диагностики COVID-19 необходима эпидемиологическая и медицинская информация, личные симптомы/признаки, а также рентгенологические и лабораторные данные2. С тех пор, как в Ухане, Китай, была зарегистрирована вспышка COVID-19, по всему миру было разработано множество коммерческих тестов амплификации нуклеиновых кислот (МАНК). Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в реальном времени (рОТ-ПЦР) используется в качестве рутинного и стандартного метода лабораторной диагностики инфекции тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2)3. Молекулярное обнаружение SARS-CoV-2 обычно основано на генах N (ген белка нуклеокапсида), E (ген белка оболочки) и RdRp (ген РНК-зависимой РНК-полимеразы) в ORF1a/b (открытая рамка считывания 1a/b). . ген) область, идентифицированная из вирусного генома. Они считаются основными консервативными участками вирусных геномов, предназначенными для распознавания вирусов4. Среди этих генов гены RdRp и E обладают высокой аналитической чувствительностью обнаружения, тогда как ген N имеет низкую аналитическую чувствительность5.
Производительность ПЦР-анализа может варьироваться в зависимости от различных факторов, таких как: реагенты для экстракции, реагенты для амплификации/обнаружения, метод экстракции, качество аппарата для ПЦР и других инструментов. По состоянию на апрель 2020 года более 48 различных диагностических устройств из девяти стран получили разрешение на экстренное использование (EUA) для диагностики COVID-196. В Эфиопии более 14 платформ ПЦР в реальном времени используются для ПЦР-обнаружения SARS-CoV-2 в 26 учреждениях общественного здравоохранения, включая ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 и Quant-studio7. Кроме того, доступны различные наборы для ПЦР-тестов, такие как тест Daan Gene, тест Abbott SARS-CoV-2, тест Sansure Biotech и тест SARS-CoV-2 BGI. Хотя рОТ-ПЦР обладает высокой чувствительностью, некоторые пациенты с COVID-19 сообщают о ложноотрицательных результатах из-за недостаточного количества копий вирусной рибонуклеиновой кислоты (РНК) в образцах из-за неправильного сбора, транспортировки, хранения и обращения, а также лабораторных исследований. условия и действия персонала8. Кроме того, неправильное обращение с образцом или контролем, установка порога цикла (Ct) и перекрестная реактивность с другими патогенными нуклеиновыми кислотами или неактивной/остаточной РНК SARS-CoV-2 могут привести к ложноположительным результатам в анализах rRT-PCR9. Таким образом, очевидно, что ПЦР-тесты действительно могут идентифицировать носителей фрагментов генов, поскольку они не могут даже различить действительно активные вирусные гены, поэтому тесты могут идентифицировать только носителей, а не пациентов10. Поэтому важно оценивать эффективность диагностики, используя стандартные в наших условиях методы. Хотя многие реагенты для МАНК доступны в Эфиопском институте общественного здравоохранения (EPHI) и по всей стране, сравнительная оценка их эффективности пока не проводилась. Таким образом, данное исследование было направлено на оценку сравнительной эффективности коммерчески доступных наборов для обнаружения SARS-CoV-2 с помощью рОТ-ПЦР с использованием клинических образцов.
В это исследование были включены в общей сложности 164 участника с подозрением на COVID-19. Большинство образцов были из лечебных центров (118/164 = 72%), тогда как остальные 46 (28%) участников были из нелечебных центров. Среди участников, не проходивших лечение в центре, у 15 (9,1%) были клинически подозреваемые случаи, а у 31 (18,9%) были контакты с подтвержденными случаями. Девяносто три (56,7%) участника были мужчинами, а средний (± стандартное отклонение) возраст участников составлял 31,10 (± 11,82) года.
В этом исследовании были определены положительные и отрицательные показатели четырех тестов на COVID-19. Таким образом, положительные показатели тестов Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI и Sansure Biotech 2019-nCoV составили 59,1%, 58,5%, 57,9% и 55,5% соответственно. . Положительные и отрицательные баллы по составному эталонному стандарту (CRS) составили 97 (59,1%) и 67 (40,9%) соответственно (таблица 1). В этом исследовании определение СВК было основано на правиле «любого положительного результата», согласно которому из четырех результатов теста два или более результатов теста, давших одинаковый результат, считались истинно положительными или отрицательными.
В этом исследовании мы обнаружили отрицательное процентное согласие (NPA) 100% (95% ДИ 94,6–100) для всех анализов по сравнению с CRS. Анализ Sansure Biotechnology показал минимальный PPA 93,8% (95% ДИ 87,2–97,1), а анализ Daan Gene 2019-nCoV показал общее согласие 99,4% (95% ДИ 96,6–99,9). Напротив, общее согласие между анализом SARS-CoV-2 BGI и анализом Sansure Biotech 2019-nCoV составило 98,8% и 96,3% соответственно (таблица 2).
Коэффициент согласия Коэна каппа между результатами анализа CRS и Abbott SARS-CoV-2 полностью соответствовал (K = 1,00). Аналогично, значения каппа Коэна, обнаруженные с помощью Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI и Sansure Biotech 2019-nCoV, также полностью соответствуют CRS (K ≥ 0,925). В этом сравнительном анализе тест хи-квадрат (критерий Макнемара) показал, что результаты анализа Sansure Biotech 2019-nCoV значительно отличались от результатов CRS (p = 0,031) (таблица 2).
Как показано на рис.1 процент самого низкого значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало, что процент низких Значение Ct (< 20 Ct) составляло 50,3%, а высокое значение Ct (36–40 Ct) было 3,2%. 1 процент самого низкого значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало, что процент низких Значение Ct (< 20 Ct) составляло 50,3%, а высокое значение Ct (36–40 Ct) было 3,2%.Как показано на рис.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) анализ Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6%, значение Ct гена ORF1a/b анализ Sansure Biotech 2019-nCoV показал, что процент ниже значения Ct (< 20 Ct) содержание 50,3%, высокое значение Ct (36–40 Ct) значительно 3,2%. 1, процент самого низкого значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6%, а анализ значения Ct гена ORF1a/b Sansure Biotech 2019-nCoV показал что процент низкого значения Ct (< 20 Ct) составил 50,3%, а высокого значения Ct (36–40 Ct) составляли 3,2%.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（< 20 Ct）为87,6%, Sansure Biotech 2019-nCoV ≥ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%，高Ct 值(36–40 Ct) Стоимость составляет 3,2%. Как показано на рисунке 1, самый низкий процент значения Ct (< 20 Ct) в тесте Abbott SARS-CoV-2 (комбинация гена RdRp и N) составляет 87,6%, значение Ct гена ORF1a/b в тесте Sansure Biotech 2019-nCoV. показывает низкий Ct值(< 20 Ct) 的 процент составляет 50,3%, 高Ct值(36–40 Ct) 的 процент составляет 3,2%. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (сочетающий гены RdRp и N) имел самое низкое процентное значение Ct (< 20 Ct) в среднем 87,6%, значение Ct гена ORF1a/b в поведении Sansure Biotech 2019. - Анализ nCoV показал низкий Ct. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (объединяющий гены RdRp и N) имел самое низкое процентное значение Ct (< 20 Ct) — 87,6%, в то время как значение Ct гена ORF1a/b в тесте Sansure Исследование Biotech 2019. Анализ nCoV показал низкий Ct. Процент оценок (< 20 Ct) составил 50,3%, а процент высоких результатов Ct (36–40 Ct) составил 3,2%. Процент значений (< 20 Ct) составил 50,3%, а процент высоких значений Ct (36–40 Ct) — 3,2%.Тест Abbott SARS-CoV-2 B зафиксировал значения Ct выше 30. С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), процентное содержание которого составляло 4% (рис. 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), процентное содержание которого составляло 4% (рис. 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (>36 Ct), процент которого составлял 4% (рис. 1). С другой стороны, при анализе BGI гена SARS-CoV-2 ORF1a/b имел высокое значение Ct (>36 Ct), процентное содержание которого составило 4% (рис. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比为4%（图1). С другой стороны, при обнаружении BGI SARS-CoV-2 процент гена ORF1a/b с высоким значением Ct (>36 Ct) составляет 4% (рис. 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 процент генов ORF1a/b с переменными значениями Ct (>36 Ct) составил 4% (рис. 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 процент генов ORF1a/b с высокими значениями Ct (>36 Ct) составил 4% (рис. 1).
В этом исследовании мы взяли 164 образца носоглотки. Для всех типов анализов выделение и амплификацию РНК проводили с использованием методов и наборов, рекомендованных соответствующими производителями.
Это исследование показало, что тест Эбботта на SARS-CoV-2 имеет ту же эффективность обнаружения, что и CRS, со 100% положительным, отрицательным и общим соответствием. Согласование каппы Коэна равно 1,00, что указывает на полное согласие с CRS. Аналогичное исследование, проведенное Вашингтонским университетом в США, показало, что общая чувствительность и специфичность теста Эбботта на SARS-CoV-2 составила 93% и 100% соответственно по сравнению с лабораторным анализом (LDA) CDC. . 11. Система обнаружения SARS-CoV-2 компании Abbott основана на одновременном комбинированном обнаружении генов N и RdRp, поскольку оба гена более чувствительны, что сводит к минимуму ложноотрицательные результаты12. Исследование, проведенное в Вене, Австрия, также показало, что большие объемы экстракционных проб и объемы элюентов для обнаружения минимизируют эффекты разбавления и повышают эффективность обнаружения13. Таким образом, идеальное соответствие Abbott анализу SARS-CoV-2 может быть связано с платформой системы обнаружения, которая одновременно обнаруживает комбинаторные гены, извлекает большое количество образцов (0,5 мл) и использует большое количество элюента (40 мкл).
Наши результаты также показали, что эффективность обнаружения генетического теста Даана была почти такой же, как и у CRS. Это согласуется с исследованием14, проведенным в Аньхойском университете в Хуайнане, Китай, и с заявлением производителя о 100% положительном совпадении. Несмотря на сообщения о стабильных результатах, один образец оказался ложноотрицательным после повторного тестирования того же элюата, но оказался положительным в анализах Abbott SARS-CoV-2 и Sansure Biotech nCoV-2019. Это говорит о том, что результаты разных типов анализов могут различаться. Тем не менее, в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значительно отличался (p < 0,05) от их лабораторного эталонного анализа. Тем не менее, в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значительно отличался (p < 0,05) от их лабораторного эталонного анализа. Тем не менее, в ходе исследования, проведенного в Китае15, результаты анализа Даана Джина значительно отличались (p < 0,05) от их лабораторного эталонного анализа. Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значительно отличался (p < 0,05) от их лабораторного эталонного анализа.然而,在中国进行的研究中15,大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p < 0,05）。然而,在中国进行的研究中15,大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Даана значительно отличались (p < 0,05) по сравнению с его эталонным лабораторным тестом. Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Даана значительно отличались (p < 0,05) от результатов референс-лабораторного теста.Это несоответствие может быть связано с чувствительностью эталонного теста для выявления SARS-CoV-2, и для определения причины могут быть важны дальнейшие исследования.
Кроме того, наше исследование оценило сравнительную эффективность анализа BGI SARS-CoV-2 с CRS, показав отличное положительное процентное согласие (PPA = 97,9%), отрицательное процентное согласие (NPA = 100%) и общее процентное согласие по полу ( ОПА). ). = 98,8%). Значения Каппа Коэна показали хорошее согласие (K = 0,975). Исследования в Нидерландах16 и Китае15 показали последовательные результаты. Тест SARS-CoV-2 BGI представляет собой тест на выявление одного гена (ORF1a/b) с использованием 10 мкл элюата для амплификации/обнаружения. Несмотря на хорошее статистическое согласие с нашими эталонными результатами, анализ пропустил два положительных образца (1,22%) от общей выборки. Это может иметь огромные клинические последствия для динамики передачи инфекции как на уровне пациента, так и на уровне сообщества.
Еще одним сравнительным анализом, включенным в это исследование, был анализ Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO); общий процент совпадений составил 96,3%. Сила согласия также определялась значением Каппа Коэна, которое составляло 0,925, что указывает на полное согласие с CRS. Опять же, наши результаты идентичны исследованиям, проведенным в Центральном Южном университете в Чанше, Китай, и в клиническом лабораторном отделении Народной больницы Лючжоу, город Лючжоу, Китай17. Несмотря на то, что было зафиксировано вышеуказанное хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имел статистически значимую разницу по сравнению с CRS (p <0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано вышеуказанное хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имел статистически значимую разницу по сравнению с CRS (p <0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеет статистические сравнения по сравнению с CRS (p < 0,005). Хотя было зафиксировано хорошее статистическое согласие, указанное выше, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имел статистически значимую разницу по сравнению с CRS (p <0,005).Компания Sansure Biotech, компания Sansure Biotech, компания CRS相比具有统计学显着差异 (p < 0,005).尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （(macnemar 检验 表明 ， , sansure biotech 检测 结果与 crs 相比 具有 显着 （（p <0,005。。。。。。。。。。。。。。。。。。。）））） Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал статистическую значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech и CRS. Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое согласие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал статистически значимую разницу (p <0,005) между анализом Sansure Biotech и CRS.Шесть образцов (3,66%) оказались ложноотрицательными по сравнению с CRS (дополнительная таблица 1); это очень важно, особенно с учетом динамики передачи вируса. Приведенные выше данные также подтверждают низкий уровень обнаружения15.
В этом исследовании значения Ct определялись для каждого анализа и соответствующей платформы, при этом самое низкое среднее значение Ct было зарегистрировано в анализе Abbott SARS-CoV-2. Этот результат может быть связан с системой одновременного комбинированного генетического тестирования Abbott для обнаружения SARS-CoV-2. Таким образом, согласно рисунку 1, 87,6% результатов Abbott SARS-CoV-2 имели значения Ct ниже 20. Лишь небольшое количество результатов выборки (12,4%) находилось в диапазоне 20-30. Значения Ct выше 30 не зафиксированы. Помимо использования Abbott формата панельного генетического тестирования SARS-CoV-2, этот результат может быть связан с нижним пределом обнаружения (32,5 копий РНК/мл)18, что в три раза ниже нижнего предела компании в 100 копий РНК. /мл. мл)19.
Это исследование имеет некоторые ограничения: во-первых, у нас нет стандартных/эталонных методов [таких как определение вирусной нагрузки или других лабораторных тестов (LDA)] из-за нехватки ресурсов. Во-вторых, все образцы, использованные в этом исследовании, представляли собой мазки из носоглотки, тогда как результаты не были применимы к другим типам образцов, и, в-третьих, размер нашей выборки был небольшим.
В этом исследовании сравнивались эффективность четырех анализов рОТ-ПЦР на SARS-CoV-2 с использованием образцов из носоглотки. Все анализы обнаружения имели почти сопоставимые характеристики, за исключением анализа Sansure Biotech. Кроме того, в тесте Sansure Biotech выявлен низкий процент положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Кроме того, в тесте Sansure Biotech выявлен низкий процент положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Кроме того, в тесте Sansure Biotech был выявлен низкий процент результатов по сравнению с СВК (p < 0,05). Кроме того, тест Sansure Biotech показал низкий процент положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05).Компания Sansure Biotech разработала CRS (p < 0,05).Компания Sansure Biotech разработала CRS (p < 0,05). Кроме того, анализ Sansure Biotech имел более низкий уровень результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Кроме того, анализ Sansure Biotech имел более низкий уровень положительных результатов по сравнению с CRS (p <0,05).Анализ Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) PPA, NPA и общего согласия превысил 93,5% при значении силы согласия Коэна Каппа 0,925. Наконец, биотехнологический анализ Sansure (RUO) нуждается в дальнейшей проверке для использования в Эфиопии, и следует рассмотреть возможность проведения дополнительных исследований для оценки заявлений отдельных производителей.
Сравнительный дизайн исследования был проведен в четырех медицинских учреждениях в Аддис-Абебе, больнице Эка Котебе, церковном лечебном центре «Миллениум», мемориальной больнице Зевудиту и специализированной противотуберкулезной больнице Святого Петра. Данные были собраны в период с 1 по 31 декабря 2020 года. Медицинские учреждения для данного исследования были выбраны целенаправленно, исходя из большого количества заболевших и наличия в городе крупных лечебных центров. Аналогичным образом, инструменты, в том числе инструменты для ПЦР в реальном времени ABI 7500 и Abbott m2000, были выбраны в соответствии с рекомендациями производителей реагентов для МАНК, а для этого исследования были выбраны четыре набора для обнаружения ПЦР, поскольку большинство лабораторий в Эфиопии использовали как минимум четверо из них. Генный тест, тест Abbott SARS-CoV-2, тест Sansure Biotech и тест SARS-CoV-2 BGI, выполненные во время исследования).
Тестирование на SARS-CoV-2 проводилось с 1 по 30 декабря 2020 года с использованием 3 мл вирусной транспортной среды (VTM) (Miraclean Technology, Шэньчжэнь, Китай) от лиц, находящихся под следствием на наличие COVID-19, переданных в EPHI. Образцы из носоглотки были собраны обученными сборщиками проб и отправлены в EPHI в тройных упаковках. Перед выделением нуклеиновой кислоты каждому образцу присваивается уникальный идентификационный номер. Экстракция проводится из каждого образца сразу по прибытии с использованием ручных и автоматических методов экстракции. Таким образом, для автоматической экстракции Abbott m2000 из каждого образца экстрагировали 1,3 мл (включая мертвый объем 0,8 мл и входной объем экстракции 0,5 мл) и пропускали через систему подготовки образцов ДНК Abbott (Abbott Molecular Inc. des Plaines, Иллинойс, США). ) Партия из 96 образцов [92 образца, два контроля обнаружения и два нешаблонных контроля (NTC)] была включена в общий процесс (извлечение и обнаружение) двух раундов SARS-CoV-2 (EUA) в режиме реального времени. добыча полезных ископаемых. Аналогично, для ручного извлечения используйте одни и те же образцы (для автоматического извлечения и обнаружения). Таким образом, на протяжении всего процесса образцы по 140 мкл были аликвотированы и экстрагированы с использованием мини-набора QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) партиями по 24 штуки (включая 20 образцов, два контроля анализа и два NTC) в течение девяти раундов. Элюаты, экстрагированные вручную, были амплифицированы и обнаружены с использованием термоциклера ABI 7500 с использованием анализа SARS-CoV-2 BGI, анализа Daan Gene и анализа Sansure Biotech.
Автоматизированное выделение и очистка вирусной РНК SARS-CoV-2 осуществляется по принципу магнитных шариков с использованием реагентов Abbott для подготовки проб ДНК. Инактивацию образцов и солюбилизацию вирусных частиц проводят с использованием детергента, содержащего изотиоцианат гуанидина, для денатурации белка и инактивации РНКазы. Затем РНК отделяют от белка твердофазным разделением с использованием диоксида кремния, т.е. соль гуанидиния и щелочной pH буфера для лизиса способствуют связыванию нуклеиновых кислот с диоксидом кремния (SiO2). На этапе промывания удаляются оставшиеся белки и мусор с образованием прозрачного раствора. Прозрачную РНК выделяют из микрочастиц на основе диоксида кремния с помощью магнитного поля прибора20,21. С другой стороны, ручное выделение и очистку РНК проводят методом спин-колонки с использованием центрифугирования вместо магнитного стенда и отделения микрочастиц от элюента.
Тест Abbott на обнаружение SARS-CoV-2 в реальном времени (Abbott Molecular, Inc.) проводился в соответствии с инструкциями производителя, получившего EUA19,22 от ВОЗ и FDA. В этом протоколе инактивация образца перед экстракцией проводилась на водяной бане при температуре 56 ° C в течение 30 минут. После инактивации вируса экстракцию нуклеиновых кислот проводили на приборе Abbott m2000 SP из 0,5 мл VTM с использованием системы подготовки образцов ДНК Abbott m2000. по словам производителя. Амплификацию и детекцию проводили с использованием прибора Abbott m2000 RT-PCR, а двойную детекцию проводили для генов RdRp и N. ROX) и VIC P (запатентованный краситель) для нацеливания и обнаружения внутренних контролей, что позволяет одновременно обнаруживать оба продукта амплификации 19 .
Метод обнаружения амплификации этого набора основан на одноэтапной технологии RT-PCR. Гены ORF1a/b и N были выбраны в качестве консервативных областей с помощью Daan Gene Technology для обнаружения амплификации целевой области. Для обнаружения РНК SARS-CoV-2 в образцах были разработаны специальные праймеры и флуоресцентные зонды (зонды N-гена, меченные FAM, зонды ORF1a/b, меченные VIC). Конечный элюент и мастер-микс готовили путем добавления 5 мкл элюента к 20 мкл мастер-микса до конечного объема 25 мкл. Амплификацию и детекцию проводили одновременно на приборе для ПЦР в реальном времени ABI 750024.
Гены ORF1a/b и N выявляли с помощью диагностического набора нуклеиновых кислот Sansure Biotech nCoV-2019 (флюоресцентная ПЦР-обнаружение). Подготовьте конкретные зонды для каждого целевого гена, выбрав канал FAM для региона ORF1a/b и канал ROX для гена N. В этот набор для анализа элюент и реагенты мастер-микса добавляются следующим образом: приготовьте 30 мкл реагента мастер-микса и 20 мкл элюированного образца для детекции/амплификации. Для амплификации/обнаружения использовали ПЦР в реальном времени ABI 750025.
Тест SARS-CoV-2 BGI представляет собой флуоресцентный набор для рОТ-ПЦР в реальном времени для диагностики COVID-19. Целевая область расположена в области ORF1a/b генома SARS-CoV-2, что представляет собой метод обнаружения одного гена. Кроме того, ген домашнего хозяйства человека β-актин является внутренне регулируемым геном-мишенью. Мастер-микс готовят путем смешивания 20 мкл реагента мастер-микса и 10 мкл экстрагированного образца РНК в луночном планшете26. Для амплификации и детекции использовали флуоресцентный количественный прибор для ПЦР в реальном времени ABI 7500. Все амплификации нуклеиновых кислот, условия проведения ПЦР для каждого анализа и интерпретацию результатов выполняли согласно инструкциям соответствующего производителя (Таблица 3).
В этом сравнительном анализе мы не использовали метод эталонного стандарта для определения процентного согласия (положительного, отрицательного и общего) и других параметров сравнения для четырех анализов. Сравнение каждого теста проводилось с CRS, в этом исследовании CRS устанавливался по правилу «любой положительный» и результат определялся не по одному тесту, мы использовали как минимум два совпадающих результата теста. Кроме того, в случае передачи COVID-19 ложноотрицательные результаты более опасны, чем ложноположительные. Следовательно, чтобы как можно точнее сказать «положительный» результат CRS, по крайней мере два анализа должны быть положительными, а это означает, что по крайней мере один положительный результат, скорее всего, будет получен в результате анализа EUA. Таким образом, из четырех результатов теста два или более результатов теста, дающих одинаковый результат, считаются истинно положительными или отрицательными18,27.
Данные собирались с использованием структурированных форм извлечения данных, ввод и анализ данных выполнялись с использованием статистического программного обеспечения Excel и SPSS версии 23.0 для описательной статистики. Анализировались положительное, отрицательное и общее процентное согласие, а для определения степени согласия каждого метода с CRS использовался показатель Каппа. Значения Каппа интерпретируются следующим образом: от 0,01 до 0,20 при умеренном согласии, от 0,21 до 0,40 при общем согласии, от 0,41 до 0,60 при умеренном согласии, от 0,61 до 0,80 при большом согласии и от 0,81 до 0,99 при полном согласии28.
Этическое разрешение было получено в Университете Аддис-Абебы, и все экспериментальные протоколы этого исследования были одобрены Советом по научной этике Эфиопского института общественного здравоохранения. Справочный номер лицензии по этике EPHI: EPHI/IRB-279-2020. Все методы применялись в соответствии с рекомендациями и положениями Национального комплексного руководства Эфиопии по лечению COVID-19. Кроме того, до участия в исследовании от всех участников исследования было получено письменное информированное согласие.
Все данные, полученные или проанализированные в ходе данного исследования, включены в опубликованную статью. Данные, подтверждающие результаты этого исследования, можно получить у соответствующего автора по обоснованному запросу.
Всемирная организация здравоохранения. Рекомендации по стратегиям лабораторного тестирования на COVID-19: Временное руководство, 21 марта 2020 г. № WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (ВОЗ, 2020 г.).
Мулиу, Д.С., Пантазопулос, И. и Гургульянис, К.И. Умная диагностика COVID-19 в отделении неотложной помощи: все на практике. Мулиу, Д.С., Пантазопулос, И. и Гургульянис, К.И. Умная диагностика COVID-19 в отделении неотложной помощи: все на практике.Мулиу Д.С., Пантазопулос И. и Гугурлианис К.И. Интеллектуальная диагностика COVID-19 в отделении неотложной помощи: все на практике.Мулиу Д.С., Пантазопулос И. и Гургулянис К.И. Интеллектуальная диагностика COVID-19 в отделениях неотложной помощи: сквозная интеграция на практике. Эксперт преподобный Респир. лекарство. 3, 263–272 (2022).
Митчелл, С.Л. и Сент-Джордж, К. Оценка анализа COVID19 ID NOW EUA. Митчелл, С.Л. и Сент-Джордж, К. Оценка анализа COVID19 ID NOW EUA.Митчелл, С.Л. и Сент-Джордж, К. Оценка анализа COVID19 ID NOW EUA.Митчелл С.Л. и Сент-Джордж К. Оценка анализа COVID19 ID NOW EUA. Дж. Клинический. Вирус. 128, 104429. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
ВОЗ. Лабораторное выявление коронавирусной болезни 2019 (COVID-19) при подозрении на заболевание человека. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (по состоянию на 15 августа 2020 г.) (ВОЗ, 2020 г.).
Удугама Б. и др. Диагностика COVID-19: болезни и инструменты тестирования. АСУ Нано 14(4), 3822–3835 (2020).
Сайед С. и др. Создание Колледжа патологов Восточной, Центральной и Южной Африки – Региональной школы патологии Ближнего Востока и Южной Африки. Африка. Дж. Лаб. лекарство. 9(1), 1–8 (2020).
Эфиопский институт общественного здравоохранения, Федеральное министерство здравоохранения. Временная национальная стратегия и руководство по лабораторной диагностике COVID-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (по состоянию на 12 августа 2020 г.) (EPHI, 2020).
Волошин С., Патель Н. и Кессельхайм А.С. Ложноотрицательные тесты на проблемы и последствия инфекции SARS-CoV-2. Волошин С., Патель Н. и Кессельхайм А.С. Ложноотрицательные тесты на проблемы и последствия инфекции SARS-CoV-2.Волошин С., Патель Н. и Кессельхайм А.С. Ложноотрицательные тесты на инфекции SARS-CoV-2 и их последствия.Волошин С., Патель Н. и Кессельхайм А.С. Ложноотрицательные тесты на провокацию и влияние инфекции SARS-CoV-2. Н. англ. Дж. Медицина. 383(6), e38 (2020).
Мулиу, Д.С. и Гургульянис, К.И. Ложноположительные и ложноотрицательные случаи COVID-19: стратегии профилактики и лечения респираторных заболеваний, вакцинация и дальнейшие перспективы. Мулиу, Д.С. и Гургульянис, К.И. Ложноположительные и ложноотрицательные случаи COVID-19: стратегии профилактики и лечения респираторных заболеваний, вакцинация и дальнейшие перспективы. Мулиу, Д.С. и Гургульянис, К.И. Ложноположительные и ложноотрицательные случаи COVID-19: респираторная профилактика и стратегия лечения, вакцинация и дальнейшие перспективы. Мулиу, Д.С. и Гургульянис, К.И. Ложноположительные и ложноотрицательные случаи COVID-19: стратегии профилактики и лечения респираторных заболеваний, вакцинация и дальнейшие действия.Мулиу Д.С. и Гугурлианис К.И. Ложноположительные и ложноотрицательные случаи COVID-19: стратегии профилактики и лечения респираторных заболеваний, вакцинация и дальнейшие действия. Эксперт преподобный Респир. лекарство. 15(8), 993–1002 (2021).
Мулиу Д.С., Иоаннис П. и Константинос Г. Диагноз COVID-19 в отделении неотложной помощи: Видеть дерево, но терять лес. Мулиу Д.С., Иоаннис П. и Константинос Г. Диагноз COVID-19 в отделении неотложной помощи: Видеть дерево, но терять лес.Мулиу, Д.С., Иоаннис, П. и Константинос, Г. Диагностика COVID-19 в отделении неотложной помощи: увидеть дерево, потерять лес.Мулиу Д.С., Иоаннис П. и Константинос Г. Диагностика COVID-19 в отделениях неотложной помощи: недостаточно леса для деревьев. Появляться. лекарство. Дж. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Дельи-Анджели, Э. и др. Валидация и валидация аналитических и клинических характеристик теста Abbott RealTime SARS-CoV-2. Дж. Клинический. Вирус. 129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Моллаи, Х.Р., Афшар, А.А., Калантар-Неестанаки, Д., Фазлалипур, М. и Афлатунян, Б. Сравнение пяти наборов праймеров из разных областей генома COVID-19 для обнаружения вирусной инфекции с помощью обычной RT-PCR. Моллаи Х.Р., Афшар А.А., Калантар-Неестанаки Д., Фазлалипур М. и Афлатунян Б. Сравнение пяти наборов праймеров из разных областей генома COVID-19 для обнаружения вирусной инфекции с помощью обычной RT-PCR.Моллаи Х.Р., Афшар А.А., Калантар-Неестанаки Д., Фазлалипур М. и Афлатунян Б. Сравнение пяти наборов праймеров из разных областей генома COVID-19 для обнаружения вирусной инфекции с помощью обычной RT-PCR. Моллаи, Х.Р., Афшар, А.А., Калантар-Неестанаки, Д., Фазлалипур, М. и Афлатунян, Б. 比较来自COVID-19不同基因组区域的五个引物组, RT-PCR 检测病毒感染。 Моллаи Х.Р., Афшар А.А., Калантар-Неестанаки Д., Фазлалипур М. и Афлатунян Б. Сравнение 5 различных генетических областей COVID-19 для обнаружения вирусной инфекции с помощью обычной RT-PCR.Моллаи Х.Р., Афшар А.А., Калантар-Неестанаки Д., Фазлалипур М. и Афлатунян Б. Сравнение пяти наборов праймеров из разных регионов генома COVID-19 для обнаружения вирусной инфекции с помощью обычной RT-PCR.Иран. Дж. Микробиология. 12(3), 185 (2020).
Герцер И. и др. Предварительные результаты национальной программы внешней оценки качества обнаружения последовательностей генома SARS-CoV-2. Дж. Клинический. Вирус. 129, 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Ван, М. и др. Аналитическая оценка эффективности пяти наборов RT-PCR при тяжелом остром респираторном синдроме, коронавирусе 2. J. Clinical. лаборатория. анус. 35(1), e23643 (2021).
Ван Б. и др. Оценка семи коммерчески доступных наборов для обнаружения РНК SARS-CoV-2 в Китае на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. клинический. Химический. лаборатория. лекарство. 58(9), e149–e153 (2020).
ван Кастерен, П.Б. и др. Сравнение семи коммерческих диагностических наборов RT-PCR COVID-19. Дж. Клинический. Вирус. 128, 104412 (2020).
Лу, Ю и др. Сравнение диагностических характеристик двух наборов ПЦР для обнаружения нуклеиновых кислот SARS-CoV-2. Дж. Клинический. лаборатория. анус. 34(10), e23554 (2020).
Лефарт, PR и др. Сравнительное исследование четырех платформ для тестирования амплификации нуклеиновых кислот (NAAT) SARS-CoV-2 показало, что эффективность ID NOW значительно ухудшалась в зависимости от пациента и типа образца. диагноз. микробиология. Заразить. дисс. 99(1), 115200 (2021).
Молекула Эбботта. Вкладыш в пакет для анализа SARS-CoV-2 компании Abbott в режиме реального времени. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay. 1-12. (По состоянию на 10 августа 2020 г.) (2020 г.).
Кляйн, С. и др. Выделение РНК SARS-CoV-2 с использованием магнитных шариков для быстрого крупномасштабного обнаружения с помощью RT-qPCR и RT-LAMP. Вирус 12(8), 863 (2020).