Проведение четырех анализов амплификации нуклеиновых кислот для идентификации SARS-CoV-2 в Эфиопии

Благодарим вас за посещение Nature.com. Вы используете версию браузера с ограниченной поддержкой CSS. Для оптимальной работы рекомендуем вам обновить браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). Кроме того, для обеспечения постоянной поддержки мы отображаем сайт без стилей и JavaScript.
Отображает карусель из трёх слайдов одновременно. Используйте кнопки «Предыдущий» и «Следующий» для перемещения по трём слайдам одновременно или кнопки-ползунки в конце для перемещения по трём слайдам одновременно.
Начиная со вспышки коронавирусной инфекции 2019 года (COVID-19) по всему миру было разработано множество коммерческих тестов амплификации нуклеиновых кислот (NAAT), которые стали стандартными анализами. Хотя несколько тестов были быстро разработаны и применены для лабораторных диагностических тестов, эффективность этих тестов не была оценена в различных условиях. Поэтому данное исследование было направлено на оценку эффективности анализов Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI и Sansure Biotech с использованием Композитного референтного стандарта (CRS). Исследование проводилось в Эфиопском институте общественного здравоохранения (EPHI) с 1 по 30 декабря 2020 года. Было извлечено 164 образца из носоглотки с использованием набора QIAamp RNA mini и системы подготовки образцов Abbott DNA. Из 164 образцов 59,1% были положительными и 40,9% - отрицательными для CRS. Положительный результат теста Sansure Biotech был значительно ниже по сравнению с CRS (p < 0,05). Положительный результат теста Sansure Biotech был значительно ниже по сравнению с CRS (p < 0,05). Положительные результаты Sansure Biotech были значительно ниже по сравнению с CRS (p < 0,05). Положительные результаты Sansure Biotech были значительно ниже по сравнению с CRS (p < 0,05).与CRS 相比, Sansure Biotech 的阳性率显着较低 (p < 0,05).与CRS 相比, Sansure Biotech 的阳性率显着较低 (p < 0,05). У Sansure Biotech было значительно меньше результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). У Sansure Biotech было значительно меньше положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05).Общая согласованность четырёх анализов составила 96,3–100% по сравнению с CRS. Помимо низкой частоты положительных результатов теста Sansure Biotech, эффективность всех четырёх анализов была практически сопоставимой. Таким образом, тест Sansure Biotech [Research Only (RUO)] требует дополнительной валидации для использования в Эфиопии. Кроме того, следует рассмотреть возможность проведения дополнительных исследований для оценки соответствия анализов заявленным производителем.
Лабораторные исследования являются частью Стратегического плана Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) по обеспечению готовности и реагированию на коронавирусную инфекцию 2019 года (COVID-19). ВОЗ рекомендует странам наращивать лабораторный потенциал для повышения готовности, надлежащего ведения случаев заболевания, бдительности и быстрого реагирования на вызовы общественного здравоохранения. Это говорит о том, что роль лабораторий играет ключевую роль в определении характера заболевания и эпидемиологии новых возбудителей инфекций, а также в контроле их распространения.
Диагностика COVID-19 требует эпидемиологической и медицинской информации, личных симптомов/признаков, а также рентгенологических и лабораторных данных2. С момента сообщения о вспышке COVID-19 в Ухане, Китай, по всему миру было разработано множество коммерческих тестов амплификации нуклеиновых кислот (NAAT). Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в реальном времени (rRT-PCR) использовалась в качестве рутинного и стандартного метода лабораторной диагностики инфекции тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2)3. Молекулярное обнаружение SARS-CoV-2 обычно основано на генах N (ген белка нуклеокапсида), E (ген белка оболочки) и RdRp (ген РНК-зависимой РНК-полимеразы) в области ORF1a/b (открытая рамка считывания 1a/b), идентифицированной из вирусного генома. Они считаются основными консервативными областями, обнаруженными в вирусных геномах для распознавания вируса4. Среди этих генов гены RdRp и E имеют высокую аналитическую чувствительность обнаружения, тогда как ген N имеет низкую аналитическую чувствительность5.
Эффективность ПЦР-анализов может варьироваться в зависимости от различных факторов, таких как: реагенты для экстракции, реагенты для амплификации/детекции, метод экстракции, качество ПЦР-аппарата и других инструментов. По состоянию на апрель 2020 года более 48 различных диагностических устройств из девяти стран получили разрешение на экстренное использование (EUA) для диагностики COVID-196. В Эфиопии для ПЦР-обнаружения SARS-CoV-2 используются более 14 платформ ПЦР в реальном времени в 26 учреждениях здравоохранения, включая ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 и Quant-studio7. Кроме того, доступны различные наборы для ПЦР-тестирования, такие как тест Daan Gene, тест Abbott SARS-CoV-2, тест Sansure Biotech и тест SARS-CoV-2 BGI. Несмотря на высокую чувствительность метода ОТ-ПЦР, некоторые пациенты с COVID-19 сообщают о ложноотрицательных результатах из-за недостаточного количества копий вирусной рибонуклеиновой кислоты (РНК) в образцах из-за неправильного сбора, транспортировки, хранения и обработки, а также лабораторного тестирования. условий и действий персонала8. Кроме того, неправильное обращение с образцом или контролем, установка порога цикла (Ct) и перекрестная реакция с другими патогенными нуклеиновыми кислотами или неактивной/остаточной РНК SARS-CoV-2 могут приводить к ложноположительным результатам в анализах ОТ-ПЦР9. Таким образом, очевидно, что тесты ПЦР действительно могут выявлять носителей фрагментов генов, поскольку они не могут даже различать действительно активные вирусные гены, поэтому тесты могут выявлять только носителей, а не пациентов10. Поэтому важно оценивать диагностическую эффективность с использованием стандартных методов в наших условиях. Хотя многие реагенты NAAT доступны в Эфиопском институте общественного здравоохранения (EPHI) и по всей стране, сравнительная оценка их эффективности до сих пор не проводилась. Таким образом, целью данного исследования была сравнительная оценка эффективности имеющихся в продаже наборов для обнаружения SARS-CoV-2 методом ОТ-ПЦР с использованием клинических образцов.
В исследование были включены 164 участника с подозрением на COVID-19. Большинство образцов были получены из лечебных центров (118/164 = 72%), в то время как оставшиеся 46 (28%) участников были из центров, где лечение не проводилось. Среди участников, не проходивших лечение в центре, у 15 (9,1%) были клинические подозрения на COVID-19, а у 31 (18,9%) был контакт с лицами, у которых был подтверждён диагноз. Девяносто три участника (56,7%) были мужчинами, а средний возраст участников (± SD) составил 31,10 (± 11,82) года.
В данном исследовании были определены положительные и отрицательные показатели четырёх тестов на COVID-19. Таким образом, положительные показатели теста Abbott SARS-CoV-2, теста Daan Gene 2019-nCoV, теста SARS-CoV-2 BGI и теста Sansure Biotech 2019-nCoV составили 59,1%, 58,5%, 57,9% и 55,5% соответственно. Положительные и отрицательные баллы композитного референтного стандарта (CRS) составили 97 (59,1%) и 67 (40,9%) соответственно (таблица 1). В данном исследовании определение CRS основывалось на правиле «любой положительный», согласно которому из четырёх результатов теста два или более результатов теста, давших одинаковый результат, считались истинно положительными или истинно отрицательными.
В данном исследовании мы обнаружили отрицательное процентное согласие (NPA) 100% (95% ДИ 94,6–100) для всех анализов по сравнению с CRS. Анализ Sansure Biotechnology показал минимальное PPA 93,8% (95% ДИ 87,2–97,1), а анализ Daan Gene 2019-nCoV имел общее согласие 99,4% (95% ДИ 96,6–99,9). Напротив, общее согласие между тестом SARS-CoV-2 BGI и тестом Sansure Biotech 2019-nCoV составило 98,8% и 96,3% соответственно (таблица 2).
Коэффициент согласия каппа Коэна между результатами CRS и Abbott SARS-CoV-2 полностью соответствовал (K = 1,00). Аналогично, значения каппа Коэна, полученные с помощью Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI и Sansure Biotech 2019-nCoV, также полностью соответствуют CRS (K ≥ 0,925). В данном сравнительном анализе критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал, что результаты анализа Sansure Biotech 2019-nCoV достоверно отличались от результатов CRS (p = 0,031) (таблица 2).
Как показано на рис.1 процент самого низкого значения Ct (<20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало, что процент низкого значения Ct (<20 Ct) составил 50,3%, а высокого значения Ct (36–40 Ct) — 3,2%. 1 процент самого низкого значения Ct (<20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало, что процент низкого значения Ct (<20 Ct) составил 50,3%, а высокого значения Ct (36–40 Ct) — 3,2%.Как показано на рис.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6%, значение Ct гена ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало, что процентное значение Ct (< 20 Ct) составило 50,3%, хорошее значение Ct (36–40 Ct) 3,2%. 1, процент анализа самого низкого значения Ct (<20 Ct) Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6%, а анализ значения Ct гена ORF1a/b Sansure Biotech 2019-nCoV показал, что процент низкого значения Ct (<20 Ct) составил 50,3%, а высокого значения Ct (36–40 Ct) составил 3,2%.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（< 20 Ct）为87,6%, Sansure Biotech 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%, 高Ct 值(36–40 Ct)的百分比为3,2%. Как показано на рисунке 1, самое низкое процентное значение Ct (< 20 Ct) теста Abbott SARS-CoV-2 (комбинация генов RdRp и N) составляет 87,6%, значение Ct гена ORF1a/b теста Sansure Biotech 2019-nCoV показывает низкое процентное значение Ct值(< 20 Ct) 的 равно 50,3%, процентное значение Ct值(36–40 Ct) 的 равно 3,2%. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (сочетающий гены RdRp и N) имел самое низкое процентное значение Ct (< 20 Ct) в среднем 87,6%, значение Ct гена ORF1a/b в процессе Sansure Biotech 2019. Анализ nCoV показал низкий Ct. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (объединяющий гены RdRp и N) имел самое низкое процентное значение Ct (<20 Ct) на уровне 87,6%, тогда как значение Ct гена ORF1a/b в исследовании Sansure Biotech 2019 – Анализ nCoV показал низкое значение Ct. Процент оценок (< 20 Ct) составил 50,3%, а процент высоких результатов Ct (36–40 Ct) составил 3,2%. Процент значений (< 20 Ct) составил 50,3%, а процент высоких значений Ct (36–40 Ct) составил 3,2%.Тест Abbott SARS-CoV-2 B зафиксировал значения Ct выше 30. С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), процент составил 4% (рис. 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), процент составил 4% (рис. 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (>36 Ct), процент которого составлял 4% (рис. 1). С другой стороны, при анализе BGI ген ORF1a/b SARS-CoV-2 имел высокое значение Ct (> 36 Ct), процент которого составил 4% (рис. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比为4%（图1). С другой стороны, при обнаружении BGI SARS-CoV-2 процент гена ORF1a/b с высоким значением Ct (>36 Ct) составляет 4% (рисунок 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 процент генов ORF1a/b с переменными значениями Ct (>36 Ct) составил 4% (рис. 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 процент генов ORF1a/b с высокими значениями Ct (>36 Ct) составил 4% (рис. 1).
В данном исследовании было отобрано 164 образца из носоглотки. Для всех типов анализов выделение и амплификация РНК проводились с использованием методов и наборов, рекомендованных соответствующими производителями.
Это исследование продемонстрировало, что тест Abbott для SARS-CoV-2 имеет ту же эффективность обнаружения, что и CRS, со 100% положительным, отрицательным и общим соответствием. Согласие каппа Коэна составляет 1,00, что указывает на полное согласие с CRS. Аналогичное исследование, проведенное Вашингтонским университетом в США, показало, что общая чувствительность и специфичность теста Abbott для SARS-CoV-2 составила 93% и 100% соответственно по сравнению с лабораторно определенным анализом (LDA) CDC. 11. Система обнаружения Abbott SARS-CoV-2 основана на одновременном комбинированном обнаружении генов N и RdRp, поскольку оба гена более чувствительны, что сводит к минимуму ложноотрицательные результаты12. Исследование, проведенное в Вене, Австрия, также показало, что большие объемы образцов для экстракции и объемы элюента для детекции минимизируют эффекты разбавления и повышают эффективность обнаружения13. Таким образом, идеальное соответствие Abbott для анализа SARS-CoV-2 может быть связано с платформенной системой обнаружения, которая одновременно обнаруживает комбинаторные гены, извлекает большое количество образцов (0,5 мл) и использует большой объем элюента (40 мкл).
Наши результаты также показали, что эффективность генетического теста Daan практически не отличается от эффективности CRS. Это согласуется с исследованием14, проведенным в Аньхойском университете в Хуайнане (Китай), и заявлением производителя о 100% совпадении результатов. Несмотря на сообщения о согласованности результатов, один образец оказался ложноотрицательным после повторного тестирования того же элюата, но дал положительный результат в тестах Abbott SARS-CoV-2 и Sansure Biotech nCoV-2019. Это говорит о возможной вариабельности результатов при использовании разных типов тестов. Тем не менее, в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа гена Даан существенно отличался (p < 0,05) по сравнению с референтным анализом, определенным в их лаборатории. Тем не менее, в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа гена Даан существенно отличался (p < 0,05) по сравнению с референтным анализом, определенным в их лаборатории. Тем не менее, в ходе исследования, проведенного в Китае15, результаты анализа Даана Джина значительно отличались (p < 0,05) от их лабораторного эталонного анализа. Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene существенно отличался (p < 0,05) от их лабораторного контрольного анализа.然而,在中国进行的研究中15,大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p < 0,05）。然而,在中国进行的研究中15,大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Даана значительно отличались (p < 0,05) по сравнению с его эталонным лабораторным тестом. Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Даана существенно отличались (p < 0,05) по сравнению с его референтным лабораторным тестом.Это расхождение может быть связано с чувствительностью эталонного теста для выявления SARS-CoV-2, и для определения причины могут потребоваться дальнейшие исследования.
Кроме того, наше исследование оценило сравнительную эффективность анализа SARS-CoV-2 BGI с CRS, показав отличное положительное процентное согласие (PPA = 97,9%), отрицательное процентное согласие (NPA = 100%) и общее процентное согласие по полу (OPA). ). = 98,8%). Значения каппа Коэна показали хорошее согласие (K = 0,975). Исследования в Нидерландах16 и Китае15 показали согласованные результаты. Тест SARS-CoV-2 BGI представляет собой тест на обнаружение одного гена (ORF1a/b) с использованием 10 мкл элюата амплификации/детекции. Несмотря на хорошее статистическое согласие с нашими референтными результатами, анализ пропустил два положительных образца (1,22%) от общей выборки. Это может иметь огромные клинические последствия для динамики передачи как на уровне пациента, так и на уровне сообщества.
Другим сравнительным анализом, включенным в данное исследование, был анализ ОТ-ПЦР (RUO) Sansure Biotech nCoV-2019; общий процент совпадения составил 96,3%. Сила совпадения также определялась значением каппа Коэна, которое составило 0,925, что указывает на полное совпадение с CRS. Наши результаты вновь идентичны исследованиям, проведенным в Центральном южном университете в Чанше (Китай) и в клиническом лабораторном отделении Народной больницы Лючжоу (город Лючжоу, Китай)17. Несмотря на то, что было зафиксировано хорошее статистическое соответствие, тест хи-квадрат (тест Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имел статистически значимое отличие по сравнению с CRS (p < 0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано хорошее статистическое соответствие, тест хи-квадрат (тест Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имел статистически значимое отличие по сравнению с CRS (p < 0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеет статистические сравнения по сравнению с CRS (p < 0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано хорошее статистическое согласие, тест хи-квадрат (тест Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имел статистически значимое отличие по сравнению с CRS (p < 0,005).Компания Sansure Biotech, компания Sansure Biotech, компания CRS相比具有统计学显着差异 (p < 0,005).尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （(macnemar 检验 表明 ， , sansure biotech 检测 结果与 crs 相比 具有 显着 （（p <0,005。。。。。。。。。。。。。。。。。。。）））） Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал статистическую значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech и CRS. Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое согласие, тест хи-квадрат (тест Макнемара) показал статистически значимое различие (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech и CRS.Шесть образцов (3,66%) оказались ложноотрицательными по сравнению с CRS (Дополнительная таблица 1); это очень важно, особенно учитывая динамику распространения вируса. Приведенные выше данные также подтверждают этот низкий уровень выявления15.
В этом исследовании значения Ct были определены для каждого анализа и соответствующей платформы, при этом наименьшее среднее значение Ct было получено в анализе Abbott SARS-CoV-2. Этот результат может быть связан с одновременной комбинированной генетической системой тестирования Abbott для обнаружения SARS-CoV-2. Таким образом, согласно рисунку 1, 87,6% результатов Abbott SARS-CoV-2 имели значения Ct ниже 20. Только небольшое количество результатов образцов (12,4%) находились в диапазоне 20-30. Значения Ct выше 30 не были зарегистрированы. Помимо использования Abbott формата генетического тестирования панели SARS-CoV-2, этот результат может быть связан с нижним пределом обнаружения (32,5 копий РНК/мл)18, что в три раза ниже нижнего предела компании в 100 копий РНК/мл. мл)19.
Данное исследование имеет ряд ограничений: во-первых, у нас нет стандартных/референтных методов [таких как вирусная нагрузка или другие лабораторные тесты (LDA)] из-за нехватки ресурсов. Во-вторых, все образцы, использованные в данном исследовании, представляли собой мазки из носоглотки, а полученные результаты неприменимы к другим типам образцов, и, в-третьих, размер нашей выборки был небольшим.
В этом исследовании сравнивалась эффективность четырёх анализов ОТ-ПЦР с обратной транскрипцией (РВ-ПЦР) для SARS-CoV-2 с использованием образцов из носоглотки. Все тесты показали практически сопоставимую эффективность, за исключением анализа Sansure Biotech. Кроме того, в анализе Sansure Biotech был выявлен низкий процент позитивности по сравнению с CRS (p < 0,05). Кроме того, в анализе Sansure Biotech был выявлен низкий процент позитивности по сравнению с CRS (p < 0,05). Кроме того, в тесте Sansure Biotech был выявлен низкий процент результатов по сравнению с СВК (p < 0,05). Кроме того, тест Sansure Biotech показал низкий процент положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05).Компания Sansure Biotech разработала CRS (p < 0,05).Компания Sansure Biotech разработала CRS (p < 0,05). Кроме того, анализ Sansure Biotech имел более низкий уровень результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Кроме того, анализ Sansure Biotech имел более низкий уровень положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05).Анализ PPA, NPA и общего согласия, проведенный Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO), превысил 93,5% при силе согласия по коэффициенту Коэна-Каппа 0,925. Наконец, анализ Sansure Biotech Assay (RUO) требует дальнейшей валидации для использования в Эфиопии, а также следует рассмотреть возможность проведения дополнительных исследований для оценки заявлений отдельных производителей.
Сравнительное исследование проводилось в четырех медицинских учреждениях Аддис-Абебы: больнице Эка Котебе, лечебном центре церкви Миллениум, мемориальной больнице Зевудиту и специализированной туберкулезной больнице Святого Петра. Данные собирались в период с 1 по 31 декабря 2020 года. Медицинские учреждения для этого исследования были целенаправленно выбраны с учетом большого количества случаев заболевания и наличия в городе крупных лечебных центров. Аналогичным образом, приборы, включая приборы для ПЦР в реальном времени ABI 7500 и Abbott m2000, были выбраны в соответствии с рекомендациями производителей реагентов МАНК, а для этого исследования были выбраны четыре набора для ПЦР-диагностики, поскольку большинство лабораторий в Эфиопии использовали по крайней мере четыре из них. Тест Gene, тест Abbott SARS-CoV-2, тест Sansure Biotech и тест SARS-CoV-2 BGI, проведенные в ходе исследования.
Тестирование на SARS-CoV-2 проводилось с 1 по 30 декабря 2020 года с использованием 3 мл вирусной транспортной среды (VTM) (Miraclean Technology, Шэньчжэнь, Китай) у лиц, находящихся под следствием по COVID-19, направленных в EPHI. Образцы из носоглотки собирали обученные сборщики образцов и отправляли в EPHI в тройных упаковках. Перед выделением нуклеиновых кислот каждому образцу присваивается уникальный идентификационный номер. Экстракция проводится из каждого образца сразу по прибытии с использованием ручных и автоматических методов экстракции. Так, для автоматической экстракции Abbott m2000 из каждого образца извлекалось 1,3 мл (включая 0,8 мл мертвого объема и 0,5 мл входного объема экстракции) образца и пропускалось через систему подготовки образцов ДНК Abbott (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, США). ) Партия из 96 [92 образцов, два контроля обнаружения и два нешаблонных контроля (NTC)] была включена в общий процесс (извлечение и обнаружение) двух раундов SARS-CoV-2 (EUA) в режиме реального времени. майнинга. Аналогично, для ручной экстракции используйте те же образцы (для автоматической экстракции и обнаружения). Таким образом, на протяжении всего процесса образцы по 140 мкл аликвотировались и экстрагировались с помощью набора QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Хильден, Германия) партиями по 24 (включая 20 образцов, два контроля анализа и два NTC) в течение девяти раундов. Извлеченные вручную элюаты амплифицировались и детектировались с помощью термоциклера ABI 7500 с использованием анализа SARS-CoV-2 BGI, анализа Daan Gene и анализа Sansure Biotech.
Автоматизированное выделение и очистка вирусной РНК SARS-CoV-2 следует принципу магнитных частиц с использованием реагентов для подготовки образцов ДНК Abbott. Инактивация образцов и солюбилизация вирусных частиц проводятся с использованием детергента, содержащего гуанидинизотиоцианат, для денатурации белка и инактивации РНКазы. Затем РНК отделяется от белка твердофазным разделением с использованием силикагеля, т. е. соль гуанидиния и щелочной pH лизирующего буфера способствуют связыванию нуклеиновых кислот с силикагелем (SiO2). Этап промывки удаляет оставшиеся белки и дебрис, получая прозрачный раствор. Прозрачная РНК выделяется из микрочастиц на основе силикагеля с использованием магнитного поля прибора20,21. С другой стороны, ручное выделение и очистка РНК проводятся методом спин-колонок с использованием центрифугирования вместо магнитного штатива и отделения микрочастиц от элюента.
Тест на выявление SARS-CoV-2 в реальном времени компании Abbott (Abbott Molecular, Inc.) был выполнен в соответствии с инструкциями производителя, получившего EUA19,22 от ВОЗ и FDA. В этом протоколе инактивация образца перед экстракцией проводилась на водяной бане при температуре 56 °C в течение 30 мин. После инактивации вируса экстракция нуклеиновых кислот проводилась на приборе Abbott m2000 SP из 0,5 мл VTM с использованием системы подготовки образцов ДНК Abbott m2000. в соответствии с инструкциями производителя. Амплификацию и детекцию проводили с помощью прибора Abbott m2000 RT-PCR, а двойная детекция проводилась для генов RdRp и N. ROX) и VIC P (запатентованный краситель) для нацеливания и обнаружения внутренних контролей, что позволяло одновременно обнаруживать оба продукта амплификации 19 .
Метод детекции амплификации в данном наборе основан на одностадийной технологии ОТ-ПЦР. Гены ORF1a/b и N были выбраны компанией Daan Gene Technology в качестве консервативных участков для детекции амплификации целевого участка. Для обнаружения РНК SARS-CoV-2 в образцах были разработаны специфические праймеры и флуоресцентные зонды (зонды гена N, меченные FAM, и зонды ORF1a/b, меченные VIC). Конечный элюент и мастер-микс готовили путем добавления 5 мкл элюента к 20 мкл мастер-микса до конечного объема 25 мкл. Амплификацию и детекцию проводили одновременно на приборе для ПЦР в реальном времени ABI 750024.
Гены ORF1a/b и N были обнаружены с помощью набора для диагностики нуклеиновых кислот nCoV-2019 Sansure Biotech (флуоресцентная ПЦР-детекция). Подготовьте специфические зонды для каждого целевого гена, выбрав канал FAM для области ORF1a/b и канал ROX для гена N. В этот набор для анализа добавляют элюент и мастер-микс реагентов следующим образом: подготовьте 30 мкл мастер-микса реагентов и 20 мкл элюированного образца для детекции/амплификации. Для амплификации/детекции использовали ПЦР в реальном времени ABI 750025.
Тест SARS-CoV-2 BGI представляет собой набор для флуоресцентной ОТ-ПЦР в реальном времени для диагностики COVID-19. Целевая область расположена в области ORF1a/b генома SARS-CoV-2, что является методом обнаружения одного гена. Кроме того, человеческий ген домашнего хозяйства β-актин является внутренне регулируемым целевым геном. Мастер-микс готовят путем смешивания 20 мкл реагента мастер-микс и 10 мкл выделенного образца РНК в луночном планшете26. Для амплификации и детекции использовали флуоресцентный количественный ПЦР в реальном времени ABI 7500. Все амплификации нуклеиновых кислот, условия проведения ПЦР для каждого анализа и интерпретация результатов выполнялись в соответствии с инструкциями соответствующего производителя (таблица 3).
В этом сравнительном анализе мы не использовали метод эталонного стандарта для определения процента согласия (положительного, отрицательного и общего) и других параметров сравнения для четырех анализов. Каждое тестовое сравнение проводилось с CRS, в этом исследовании CRS был установлен по правилу «любой положительный», и результат определялся не одним тестом, мы использовали по крайней мере два совпадающих результата теста. Кроме того, в случае передачи COVID-19 ложноотрицательные результаты более опасны, чем ложноположительные. Поэтому, чтобы сказать «положительный» как можно точнее по результату CRS, по крайней мере два теста анализа должны быть положительными, что означает, что по крайней мере один положительный результат, вероятно, будет получен из анализа EUA. Таким образом, из четырех результатов теста два или более результатов теста, которые дают одинаковый результат, считаются истинно положительными или отрицательными18,27.
Данные собирались с помощью структурированных форм извлечения данных, ввод и анализ данных выполнялись с помощью статистического программного обеспечения Excel и SPSS версии 23.0 для описательной статистики. Анализировались положительные, отрицательные и общие процентные значения согласия, а для определения степени согласия каждого метода с CRS использовалась оценка Каппа. Значения Каппа интерпретируются следующим образом: от 0,01 до 0,20 – слабое согласие, от 0,21 до 0,40 – общее согласие, от 0,41 до 0,60 – умеренное согласие, от 0,61 до 0,80 – значительное согласие и от 0,81 до 0,99 – полное согласие28.
Этическое разрешение было получено от Университета Аддис-Абебы, а все экспериментальные протоколы данного исследования были одобрены Советом по научной этике Эфиопского института общественного здравоохранения. Регистрационный номер этической лицензии EPHI: EPHI/IRB-279-2020. Все методы применялись в соответствии с рекомендациями и положениями Эфиопских национальных комплексных руководств по лечению COVID-19. Кроме того, перед участием в исследовании было получено письменное информированное согласие всех участников.
Все данные, полученные или проанализированные в ходе данного исследования, включены в настоящую опубликованную статью. Данные, подтверждающие результаты данного исследования, могут быть предоставлены соответствующим автором по обоснованному запросу.
Всемирная организация здравоохранения. Рекомендации по стратегиям лабораторного тестирования на COVID-19: Временное руководство, 21 марта 2020 г. № WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (ВОЗ, 2020).
Мулиу, Д.С., Пантазопулос, И. и Гургулианис, К.И. Интеллектуальная диагностика COVID-19 в отделении неотложной помощи: комплексное решение на практике. Мулиу, Д.С., Пантазопулос, И. и Гургулианис, К.И. Интеллектуальная диагностика COVID-19 в отделении неотложной помощи: комплексное решение на практике.Мулиу, Д.С., Пантазопулос, И. и Гургулианис, К.И. Интеллектуальная диагностика COVID-19 в отделении неотложной помощи: все на практике.Мулиу Д.С., Пантазопулос И. и Гургулянис К.И. Интеллектуальная диагностика COVID-19 в отделениях неотложной помощи: сквозная интеграция на практике. Эксперт-достопочтенный Респир. медицина. 3, 263–272 (2022).
Митчелл, С.Л. и Сент-Джордж, К. Оценка анализа COVID19 ID NOW EUA. Митчелл, С.Л. и Сент-Джордж, К. Оценка анализа COVID19 ID NOW EUA.Митчелл, С.Л. и Сент-Джордж, К. Оценка анализа COVID19 ID NOW EUA.Митчелл С.Л. и Сент-Джордж К. Оценка теста COVID19 ID NOW EUA. J. Clinical. Virus. 128, 104429. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
ВОЗ. Лабораторное выявление коронавирусной инфекции 2019 года (COVID-19) у людей с подозрением на заболевание. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (дата обращения: 15 августа 2020 г.) (ВОЗ, 2020).
Удугама, Б. и др. Диагностика COVID-19: заболевания и инструменты тестирования. ACS Nano 14(4), 3822–3835 (2020).
Сайед С. и др. Создание Коллегии патологов Восточной, Центральной и Южной Африки – Региональной школы патологии Ближнего Востока и Южной Африки. Африка. J. Lab. medicine. 9(1), 1-8 (2020).
Эфиопский институт общественного здравоохранения, Федеральное министерство здравоохранения. Временная национальная стратегия и руководство по лабораторной диагностике COVID-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (дата обращения: 12 августа 2020 г.) (EPHI, 2020).
Волошин, С., Патель, Н. и Кессельхайм, А.С. Ложноотрицательные тесты на инфекцию SARS-CoV-2: проблемы и последствия. Волошин, С., Патель, Н. и Кессельхайм, А.С. Ложноотрицательные тесты на инфекцию SARS-CoV-2: проблемы и последствия.Волошин С., Патель Н. и Кессельгейм А.С. Ложноотрицательные результаты тестов на инфекции SARS-CoV-2 и их последствия.Волошин С., Патель Н. и Кессельгейм А.С. Ложноотрицательные тесты на провокацию и влияние инфекции SARS-CoV-2. N. eng. J. Medicine. 383(6), e38 (2020).
Мулиу, Д.С. и Гургулианис, К.И. Ложноположительные и ложноотрицательные случаи COVID-19: стратегии профилактики и лечения респираторных заболеваний, вакцинация и дальнейшие перспективы. Мулиу, Д.С. и Гургулианис, К.И. Ложноположительные и ложноотрицательные случаи COVID-19: стратегии профилактики и лечения респираторных заболеваний, вакцинация и дальнейшие перспективы. Мулиу, Д.С. и Гургульянис, К.И. Ложноположительные и ложноотрицательные случаи COVID-19: респираторная профилактика и стратегия лечения, вакцинация и дальнейшие перспективы. Мулиу, Д.С. и Гургулианис, К.И. Ложноположительные и ложноотрицательные случаи COVID-19: стратегии профилактики и лечения респираторных заболеваний, вакцинация и дальнейшие шаги.Мулиу, Д.С. и Гургулианис, К.И. Ложноположительные и ложноотрицательные случаи COVID-19: стратегии респираторной профилактики и лечения, вакцинации и пути продвижения вперед. Эксперт, преподобный Респир. медицина. 15(8), 993–1002 (2021).
Мулиу, Д.С., Иоаннис, П. и Константинос, Г. Диагностика COVID-19 в отделении неотложной помощи: видим дерево, но теряем лес. Мулиу, Д.С., Иоаннис, П. и Константинос, Г. Диагностика COVID-19 в отделении неотложной помощи: видим дерево, но теряем лес.Мулиу, Д.С., Иоаннис, П. и Константинос, Г. Диагностика COVID-19 в отделении неотложной помощи: увидеть дерево, потерять лес.Мулиу Д.С., Иоаннис П. и Константинос Г. Диагностика COVID-19 в отделениях неотложной помощи: мало леса для деревьев. Appear. medicine. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. et al. Валидация и проверка аналитических и клинических характеристик теста Abbott RealTime SARS-CoV-2. J. Clinical. Virus. 129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Моллаеи, Х.Р., Афшар, А.А., Калантар-Нейестанаки, Д., Фазлалипур, М. и Афлатуниан, Б. Сравнение пяти наборов праймеров из разных областей генома COVID-19 для обнаружения вирусной инфекции с помощью традиционной ОТ-ПЦР. Моллаеи, Х.Р., Афшар, А.А., Калантар-Нейестанаки, Д., Фазлалипур, М. и Афлатуниан, Б. Сравнение пяти наборов праймеров из различных областей генома COVID-19 для обнаружения вирусной инфекции с помощью традиционной ОТ-ПЦР.Моллаеи, Х.Р., Афшар, А.А., Калантар-Неестанаки, Д., Фазлалипур, М. и Афлатунян, Б. Сравнение пяти наборов праймеров из различных регионов генома COVID-19 для обнаружения вирусной инфекции с помощью традиционной ОТ-ПЦР. Моллаи, Х.Р., Афшар, А.А., Калантар-Неестанаки, Д., Фазлалипур, М. и Афлатунян, Б. 比较来自COVID-19不同基因组区域的五个引物组, 通过常规RT-PCR 检测病毒感染。 Моллаеи, Х.Р., Афшар, А.А., Калантар-Нейестанаки, Д., Фазлалипур, М. и Афлатуниан, Б. Сравнение 5 различных генетических регионов COVID-19 для обнаружения вирусной инфекции с помощью традиционной ОТ-ПЦР.Моллаеи Х.Р., Афшар А.А., Калантар-Неестанаки Д., Фазлалипур М. и Афлатунян Б. Сравнение пяти наборов праймеров из различных регионов генома COVID-19 для обнаружения вирусной инфекции с помощью традиционной ОТ-ПЦР.Иран. Журнал микробиологии. 12(3), 185 (2020).
Герцер, И. и др. Предварительные результаты национальной программы внешней оценки качества для определения последовательностей генома SARS-CoV-2. J. Clinical. Virus. 129, 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Ван, М. и др. Аналитическая оценка эффективности пяти наборов ОТ-ПЦР для тяжелого острого респираторного синдрома, вызванного коронавирусом 2. J. Clinical. Laboratory. Anus. 35(1), e23643 (2021).
Ван Б. и др. Оценка семи коммерчески доступных наборов для обнаружения РНК SARS-CoV-2 в Китае на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Клиническая. Химическая. Лаборатория. Медицина. 58(9), стр. 149–153 (2020).
ван Кастерен, П.Б. и др. Сравнение семи коммерческих наборов для диагностики COVID-19 методом ОТ-ПЦР. J. Clinical. Virus. 128, 104412 (2020).
Лу, Ю и др. Сравнение диагностической эффективности двух наборов ПЦР для обнаружения нуклеиновых кислот SARS-CoV-2. J. Clinical. Laboratory. Anus. 34(10), e23554 (2020).
Lefart, PR и др. Сравнительное исследование четырёх платформ для анализа амплификации нуклеиновых кислот (NAAT) SARS-CoV-2 показало, что эффективность ID NOW значительно ухудшалась в зависимости от типа пациента и образца. Диагностика. Микробиология. Инфекция. Дисс. 99(1), 115200 (2021).
Молекула Abbott. Вкладыш в упаковку для анализа SARS-CoV-2 в реальном времени от Abbott. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay. 1-12. (По состоянию на 10 августа 2020 г.) (2020).
Кляйн, С. и др. Выделение РНК SARS-CoV-2 с использованием магнитных частиц для быстрого массового обнаружения методами ОТ-ПЦР и ОТ-ЛАМП. Вирус 12(8), 863 (2020).