Факторы помех в реакциях ПЦР

Во время реакции ПЦР часто встречаются некоторые мешающие факторы.
Из-за очень высокой чувствительности ПЦР загрязнение считается одним из наиболее важных факторов, влияющих на результаты ПЦР, и может давать ложноположительные результаты.
Не менее важными являются различные источники, приводящие к ложноотрицательным результатам.Если одна или несколько основных частей смеси для ПЦР или сама реакция амплификации ингибированы или мешают диагностическому анализу.Это может привести к снижению эффективности и даже ложноотрицательным результатам.
Помимо ингибирования, потеря целостности нуклеиновой кислоты-мишени может произойти из-за условий транспортировки и/или хранения до подготовки образца.В частности, высокие температуры или неправильное хранение могут привести к повреждению клеток и нуклеиновых кислот.Фиксация клеток и тканей и заливка парафином являются хорошо известными причинами фрагментации ДНК и постоянной проблемой (см. рис. 1 и 2).В этих случаях даже оптимальная изоляция и очистка не помогут.

Рисунок 1 |Влияние иммобилизации на целостность ДНК
Электрофорез в агарозном геле показал, что качество ДНК, выделенной из парафиновых срезов аутопсий, значительно различается.В экстрактах присутствовала ДНК различной средней длины фрагментов в зависимости от метода фиксации.ДНК сохранялась только при фиксации в нативных замороженных образцах и в забуференном нейтральном формалине.Использование сильнокислотного фиксатора Буэна или небуферизованного формалина, содержащего муравьиную кислоту, приводило к значительной потере ДНК.Остальная часть сильно фрагментирована.
Слева длина фрагментов выражена в тысячах пар оснований (т.п.н.)

Рисунок 2 |Потеря целостности нуклеиновых кислот-мишеней
(а) Разрыв 3'-5' на обеих цепях приведет к разрыву ДНК-мишени.синтез ДНК все равно будет происходить на маленьком фрагменте.Однако если на фрагменте ДНК отсутствует сайт отжига праймера, происходит только линейная амплификация.В наиболее благоприятном случае фрагменты могут перенасыщать друг друга, но выходы будут небольшими и ниже уровня обнаружения.
(б) Потеря оснований, в основном за счет депуринизации и образования димера тимидина, приводит к уменьшению числа Н-связей и уменьшению Tm.Во время продолжительной фазы нагревания праймеры будут оттаивать от матриксной ДНК и не будут отжигаться даже в менее строгих условиях.
(c) Соседние тиминовые основания образуют димер ТТ.
Другой распространенной проблемой, которая часто возникает в молекулярной диагностике, является неоптимальное высвобождение целевых нуклеиновых кислот по сравнению с экстракцией фенол-хлороформом.В крайних случаях это может быть связано с ложноотрицательными результатами.Много времени можно сэкономить за счет лизиса кипячением или ферментативного расщепления клеточного дебриса, но этот метод часто приводит к низкой чувствительности ПЦР из-за недостаточного высвобождения нуклеиновой кислоты.

Ингибирование активности полимеразы во время амплификации

В общем, ингибирование используется как понятие контейнера для описания всех факторов, которые приводят к субоптимальным результатам ПЦР.В строго биохимическом смысле ингибирование ограничивается активностью фермента, т. е. оно снижает или предотвращает превращение субстрата в продукт посредством взаимодействия с активным центром ДНК-полимеразы или ее кофактора (например, Mg2+ для ДНК-полимеразы Taq).
Компоненты в образце или различные буферы и экстракты, содержащие реагенты, могут непосредственно ингибировать фермент или улавливать его кофакторы (например, ЭДТА), тем самым инактивируя полимеразу и, в свою очередь, приводя к заниженным или ложноотрицательным результатам ПЦР.
Однако многие взаимодействия между компонентами реакции и нуклеиновыми кислотами, содержащими мишень, также обозначаются как «ингибиторы ПЦР».Как только целостность клетки нарушается при выделении и высвобождается нуклеиновая кислота, может происходить взаимодействие между образцом, окружающим его раствором и твердой фазой.Например, «поглотители» могут связываться с одноцепочечной или двухцепочечной ДНК посредством нековалентных взаимодействий и мешать выделению и очистке, уменьшая количество мишеней, которые в конечном итоге достигают реакционного сосуда для ПЦР.
В целом ингибиторы ПЦР присутствуют в большинстве биологических жидкостей и реагентов, используемых для клинических диагностических тестов (мочевина в моче, гемоглобин и гепарин в крови), пищевых добавках (органические компоненты, гликоген, жир, ионы Са2+) и компонентах окружающей среды (фенолы). , тяжелые металлы)

Более распространенные ингибиторы ПЦР можно найти в бактериях и эукариотических клетках, нецелевой ДНК, ДНК-связывающих макромолекулах тканевых матриц и лабораторном оборудовании, таком как перчатки и пластмассы.Очистка нуклеиновых кислот во время или после экстракции является предпочтительным методом удаления ингибиторов ПЦР.
Сегодня различное автоматизированное оборудование для экстракции может заменить многие ручные протоколы, но 100% извлечение и/или очистка мишеней никогда не были достигнуты.Потенциальные ингибиторы могут все еще присутствовать в очищенных нуклеиновых кислотах или могут уже действовать.Существуют различные стратегии снижения воздействия ингибиторов.Выбор подходящей полимеразы может оказать существенное влияние на активность ингибитора.Другими проверенными методами снижения ингибирования ПЦР являются увеличение концентрации полимеразы или применение добавок, таких как BSA.
Ингибирование реакций ПЦР можно продемонстрировать с помощью внутреннего контроля качества процесса (IPC).
Необходимо тщательно удалить все реагенты и другие растворы в наборе для экстракции, такие как этанол, ЭДТА, ЦЕТАБ, LiCl, GuSCN, SDS, изопропанол и фенол, из изолята нуклеиновой кислоты путем тщательной промывки.В зависимости от их концентрации они могут активировать или ингибировать ПЦР.