Факторы интерференции в реакциях ПЦР

В ходе ПЦР-реакции часто встречаются мешающие факторы.
В связи с очень высокой чувствительностью ПЦР загрязнение считается одним из важнейших факторов, влияющих на результаты ПЦР, и может приводить к ложноположительным результатам.
Не менее важны и различные источники ложноотрицательных результатов. Если один или несколько важных компонентов ПЦР-смеси или сама реакция амплификации ингибируются или нарушаются, диагностический анализ может быть затруднен. Это может привести к снижению эффективности и даже к ложноотрицательным результатам.
Помимо ингибирования, потеря целостности целевой нуклеиновой кислоты может быть вызвана условиями транспортировки и/или хранения до подготовки образца. В частности, высокие температуры или ненадлежащее хранение могут привести к повреждению клеток и нуклеиновых кислот. Фиксация клеток и тканей, а также заливка в парафин – хорошо известные причины фрагментации ДНК, представляющие собой хроническую проблему (см. рисунки 1 и 2). В этих случаях даже оптимальная изоляция и очистка не помогут.

Рисунок 1 | Влияние иммобилизации на целостность ДНК
Электрофорез в агарозном геле показал, что качество ДНК, выделенной из парафиновых срезов аутопсий, значительно различается. В экстрактах присутствовали фрагменты ДНК различной средней длины в зависимости от метода фиксации. ДНК сохранялась только при фиксации в нативных замороженных образцах и в забуференном нейтральном формалине. Использование сильнокислотного фиксатора Буэна или небуферированного формалина, содержащего муравьиную кислоту, приводило к значительной потере ДНК. Оставшаяся фракция сильно фрагментирована.
Слева длина фрагментов выражена в килопарах оснований (т.п.н.).

Рисунок 2 | Потеря целостности целевых нуклеиновых кислот
(а) Разрыв 3′–5′ на обеих цепях приведёт к разрыву целевой ДНК. Синтез ДНК на небольшом фрагменте всё равно будет происходить. Однако, если на фрагменте ДНК отсутствует сайт отжига праймера, происходит только линейная амплификация. В наиболее благоприятном случае фрагменты могут ренатурировать друг друга, но выходы будут низкими и ниже уровня обнаружения.
(б) Потеря оснований, в основном за счёт депуринизации и образования тимидинового димера, приводит к уменьшению количества водородных связей и снижению Tm. Во время продолжительной фазы нагревания праймеры будут растворяться в матричной ДНК и не будут отжигаться даже в менее жёстких условиях.
(c) Соседние основания тимина образуют димер ТТ.
Другая распространённая проблема, часто встречающаяся в молекулярной диагностике, — это неоптимальное высвобождение целевых нуклеиновых кислот по сравнению с фенол-хлороформной экстракцией. В крайних случаях это может приводить к ложноотрицательным результатам. Значительную экономию времени можно достичь, используя лизис кипячением или ферментативное расщепление клеточного детрита, но этот метод часто приводит к низкой чувствительности ПЦР из-за недостаточного высвобождения нуклеиновых кислот.

Ингибирование активности полимеразы во время амплификации

В целом, ингибирование используется как общее понятие для описания всех факторов, приводящих к неоптимальным результатам ПЦР. В строго биохимическом смысле ингибирование ограничивается активностью фермента, то есть оно снижает или предотвращает превращение субстрата в продукт посредством взаимодействия с активным центром ДНК-полимеразы или её кофактором (например, Mg2+ для Taq ДНК-полимеразы).
Компоненты в образце или различные буферы и экстракты, содержащие реагенты, могут напрямую ингибировать фермент или улавливать его кофакторы (например, ЭДТА), тем самым инактивируя полимеразу и, в свою очередь, приводя к заниженным или ложноотрицательным результатам ПЦР.
Однако многие взаимодействия между компонентами реакции и содержащими мишень нуклеиновыми кислотами также называются «ингибиторами ПЦР». После нарушения целостности клетки в процессе выделения и высвобождения нуклеиновой кислоты могут возникнуть взаимодействия между образцом, окружающим его раствором и твёрдой фазой. Например, «поглотители» могут связывать одно- или двухцепочечную ДНК посредством нековалентных взаимодействий и препятствовать выделению и очистке, уменьшая количество мишеней, которые в конечном итоге попадают в реакционный сосуд для ПЦР.
В целом, ингибиторы ПЦР присутствуют в большинстве биологических жидкостей и реагентов, используемых для клинических диагностических тестов (мочевина в моче, гемоглобин и гепарин в крови), пищевых добавках (органические компоненты, гликоген, жир, ионы Ca2+) и компонентах окружающей среды (фенолы, тяжелые металлы).

Наиболее распространённые ингибиторы ПЦР встречаются в бактериях и эукариотических клетках, нецелевой ДНК, ДНК-связывающих макромолекулах тканевых матриксов и лабораторном оборудовании, таком как перчатки и пластик. Очистка нуклеиновых кислот во время или после экстракции является предпочтительным методом удаления ингибиторов ПЦР.
Сегодня различное автоматизированное оборудование для экстракции может заменить многие ручные протоколы, но 100% извлечение и/или очистка целевых молекул никогда не достигались. Потенциальные ингибиторы могут всё ещё присутствовать в очищенных нуклеиновых кислотах или уже вступить в действие. Существуют различные стратегии для снижения влияния ингибиторов. Выбор подходящей полимеразы может существенно влиять на активность ингибитора. Другие проверенные методы снижения ингибирования ПЦР включают увеличение концентрации полимеразы или применение добавок, таких как бычий сывороточный альбумин (БСА).
Ингибирование реакций ПЦР можно продемонстрировать с помощью внутреннего контроля качества процесса (ВКП).
Необходимо тщательно удалить все реагенты и другие растворы из набора для экстракции, такие как этанол, ЭДТА, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, изопропанол и фенол, из изолята нуклеиновой кислоты путем тщательной промывки. В зависимости от концентрации, они могут активировать или ингибировать ПЦР.