Факторы интерференции в реакциях ПЦР

В ходе реакции ПЦР часто встречаются мешающие факторы.
В связи с очень высокой чувствительностью ПЦР загрязнение считается одним из важнейших факторов, влияющих на результаты ПЦР, и может приводить к ложноположительным результатам.
Не менее важными являются различные источники, которые приводят к ложноотрицательным результатам. Если одна или несколько важных частей смеси ПЦР или сама реакция амплификации ингибируются или вмешиваются, диагностический анализ может быть затруднен. Это может привести к снижению эффективности и даже ложноотрицательным результатам.
Помимо ингибирования, потеря целостности целевой нуклеиновой кислоты может произойти из-за условий транспортировки и/или хранения до подготовки образца. В частности, высокие температуры или ненадлежащее хранение могут привести к повреждению клеток и нуклеиновых кислот. Фиксация клеток и тканей и заливка парафином являются хорошо известными причинами фрагментации ДНК и постоянной проблемой (см. рисунки 1 и 2). В этих случаях даже оптимальная изоляция и очистка не помогут.

Рисунок 1 | Влияние иммобилизации на целостность ДНК
Электрофорез в агарозном геле показал, что качество ДНК, выделенной из парафиновых срезов аутопсий, значительно различалось. В экстрактах присутствовала ДНК с разной средней длиной фрагментов в зависимости от метода фиксации. ДНК сохранялась только при фиксации в нативных замороженных образцах и в забуференном нейтральном формалине. Использование сильнокислотного фиксатора Буэна или небуферированного формалина, содержащего муравьиную кислоту, приводило к значительной потере ДНК. Оставшаяся фракция сильно фрагментирована.
Слева длина фрагментов выражена в тысячах пар оснований (т.п.н.)

Рисунок 2 | Потеря целостности нуклеиновых кислот-мишеней
(a) Разрыв 3′-5′ на обеих цепях приведет к разрыву целевой ДНК. синтез ДНК все равно будет происходить на небольшом фрагменте. Однако, если на фрагменте ДНК отсутствует сайт отжига праймера, происходит только линейная амплификация. В наиболее благоприятном случае фрагменты могут повторно насыщать друг друга, но выходы будут небольшими и ниже уровней обнаружения.
(b) Потеря оснований, в основном из-за депуринизации и образования димера тимидина, приводит к уменьшению числа водородных связей и снижению Tm. Во время удлиненной фазы нагрева праймеры будут плавиться от матричной ДНК и не будут отжигаться даже в менее жестких условиях.
(c) Соседние основания тимина образуют димер ТТ.
Другая распространенная проблема, которая часто возникает в молекулярной диагностике, — это неоптимальное высвобождение целевых нуклеиновых кислот по сравнению с экстракцией фенол-хлороформом. В крайних случаях это может быть связано с ложноотрицательными результатами. Много времени можно сэкономить с помощью лизиса кипячением или ферментативного переваривания остатков клеток, но этот метод часто приводит к низкой чувствительности ПЦР из-за недостаточного высвобождения нуклеиновых кислот.

Ингибирование активности полимеразы во время амплификации

В целом, ингибирование используется как контейнерное понятие для описания всех факторов, которые приводят к неоптимальным результатам ПЦР. В строго биохимическом смысле ингибирование ограничивается активностью фермента, т. е. оно снижает или предотвращает преобразование субстрата в продукт посредством взаимодействия с активным сайтом ДНК-полимеразы или ее кофактором (например, Mg2+ для ДНК-полимеразы Taq).
Компоненты в образце или различные буферы и экстракты, содержащие реагенты, могут напрямую ингибировать фермент или захватывать его кофакторы (например, ЭДТА), тем самым инактивируя полимеразу и, в свою очередь, приводя к заниженным или ложноотрицательным результатам ПЦР.
Однако многие взаимодействия между компонентами реакции и содержащими мишень нуклеиновыми кислотами также обозначаются как «ингибиторы ПЦР». После того, как целостность клетки нарушается изоляцией и нуклеиновая кислота высвобождается, могут возникнуть взаимодействия между образцом и окружающим его раствором и твердой фазой. Например, «поглотители» могут связывать одно- или двухцепочечную ДНК посредством нековалентных взаимодействий и мешать изоляции и очистке, уменьшая количество мишеней, которые в конечном итоге достигают реакционного сосуда ПЦР.
В целом, ингибиторы ПЦР присутствуют в большинстве биологических жидкостей и реагентов, используемых для клинических диагностических тестов (мочевина в моче, гемоглобин и гепарин в крови), пищевых добавках (органические компоненты, гликоген, жир, ионы Ca2+) и компонентах окружающей среды (фенолы, тяжелые металлы).

Более распространенные ингибиторы ПЦР можно обнаружить в бактериях и эукариотических клетках, нецелевой ДНК, ДНК-связывающих макромолекулах тканевых матриц и лабораторном оборудовании, таком как перчатки и пластик. Очистка нуклеиновых кислот во время или после экстракции является предпочтительным методом удаления ингибиторов ПЦР.
Сегодня различное автоматизированное оборудование для экстракции может заменить множество ручных протоколов, но 100% извлечения и/или очистки мишеней никогда не было достигнуто. Потенциальные ингибиторы могут все еще присутствовать в очищенных нуклеиновых кислотах или уже могли вступить в силу. Существуют различные стратегии для снижения воздействия ингибиторов. Выбор подходящей полимеразы может оказать значительное влияние на активность ингибитора. Другие проверенные методы снижения ингибирования ПЦР — это увеличение концентрации полимеразы или применение добавок, таких как BSA.
Ингибирование реакций ПЦР можно продемонстрировать с помощью внутреннего контроля качества процесса (ВКП).
Необходимо тщательно удалить все реагенты и другие растворы в наборе для экстракции, такие как этанол, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, изопропанол и фенол, из изолята нуклеиновой кислоты путем тщательной промывки. В зависимости от их концентрации они могут активировать или ингибировать ПЦР.