Факторы вмешательства в реакции ПЦР

В ходе реакции ПЦР часто встречаются некоторые мешающие факторы.
Из-за очень высокой чувствительности ПЦР загрязнение считается одним из наиболее важных факторов, влияющих на результаты ПЦР, и может привести к ложноположительным результатам.
Не менее важны различные источники, приводящие к ложноотрицательным результатам. Если одна или несколько важных частей ПЦР-смеси или сама реакция амплификации ингибируются или мешают, диагностический анализ может быть затруднен. Это может привести к снижению эффективности и даже ложноотрицательным результатам.
Помимо ингибирования, потеря целостности целевой нуклеиновой кислоты может произойти из-за условий транспортировки и/или хранения до подготовки проб. В частности, высокие температуры или неправильное хранение могут привести к повреждению клеток и нуклеиновых кислот. Фиксация клеток и тканей и заливка в парафин являются хорошо известными причинами фрагментации ДНК и постоянной проблемой (см. рисунки 1 и 2). В этих случаях даже оптимальная изоляция и очистка не помогут.

Рисунок 1 | Влияние иммобилизации на целостность ДНК
Электрофорез в агарозном геле показал, что качество ДНК, выделенной из парафиновых срезов аутопсий, значительно различалось. В экстрактах в зависимости от метода фиксации присутствовала ДНК различной средней длины фрагментов. ДНК сохранялась только при фиксации в нативных замороженных образцах и в забуференном нейтральном формалине. Использование сильнокислотного фиксатора Буэна или небуферного формалина, содержащего муравьиную кислоту, приводило к значительной потере ДНК. Оставшаяся фракция сильно фрагментирована.
Слева длина фрагментов выражена в тысячных парах оснований (кбп).

Рисунок 2 | Потеря целостности мишеней нуклеиновых кислот
(а) Разрыв 3’-5’ на обеих цепях приведет к разрыву целевой ДНК. синтез ДНК все равно будет происходить на небольшом фрагменте. Однако если на фрагменте ДНК отсутствует сайт отжига праймера, происходит только линейная амплификация. В наиболее благоприятном случае фрагменты могут перенасыщать друг друга, но выходы будут небольшими и ниже уровня обнаружения.
(б) Потеря оснований, главным образом за счет депуринации и образования димера тимидина, приводит к уменьшению числа Н-связей и уменьшению Тпл. Во время продолжительной фазы потепления праймеры будут таять от матричной ДНК и не будут отжигаться даже в менее жестких условиях.
(в) Соседние тиминовые основания образуют димер ТТ.
Другая распространенная проблема, которая часто возникает в молекулярной диагностике, — это неоптимальное высвобождение целевых нуклеиновых кислот по сравнению с фенол-хлороформной экстракцией. В крайних случаях это может быть связано с ложноотрицательными результатами. Много времени можно сэкономить, используя лизис кипячением или ферментативное расщепление остатков клеток, но этот метод часто приводит к низкой чувствительности ПЦР из-за недостаточного высвобождения нуклеиновой кислоты.

Ингибирование активности полимеразы во время амплификации

В общем, ингибирование используется как контейнерная концепция для описания всех факторов, которые приводят к неоптимальным результатам ПЦР. В строго биохимическом смысле ингибирование ограничивается активностью фермента, т.е. оно уменьшает или предотвращает превращение субстрата в продукт посредством взаимодействия с активным центром ДНК-полимеразы или ее кофактора (например, Mg2+ для ДНК-полимеразы Taq).
Компоненты образца или различные буферы и экстракты, содержащие реагенты, могут напрямую ингибировать фермент или улавливать его кофакторы (например, ЭДТА), тем самым инактивируя полимеразу и, в свою очередь, приводя к снижению или ложноотрицательным результатам ПЦР.
Однако многие взаимодействия между компонентами реакции и нуклеиновыми кислотами, содержащими мишень, также обозначаются как «ингибиторы ПЦР». Как только целостность клетки нарушается в результате изоляции и нуклеиновая кислота высвобождается, может произойти взаимодействие между образцом и окружающим его раствором и твердой фазой. Например, «поглотители» могут связывать одно- или двухцепочечную ДНК посредством нековалентных взаимодействий и мешать выделению и очистке за счет уменьшения количества мишеней, которые в конечном итоге достигают реакционного сосуда ПЦР.
В целом ингибиторы ПЦР присутствуют в большинстве жидкостей организма и реагентах, используемых для клинико-диагностических исследований (мочевина в моче, гемоглобин и гепарин в крови), пищевых добавках (органические компоненты, гликоген, жир, ионы Са2+) и компонентах окружающей среды (фенолы). , тяжелые металлы)

Более распространенные ингибиторы ПЦР можно обнаружить в бактериях и эукариотических клетках, немишеневой ДНК, ДНК-связывающих макромолекулах тканевых матриц и лабораторном оборудовании, таком как перчатки и пластик. Очистка нуклеиновых кислот во время или после экстракции является предпочтительным методом удаления ингибиторов ПЦР.
Сегодня различное автоматизированное экстракционное оборудование может заменить многие ручные протоколы, но 100%-е извлечение и/или очистка целей никогда не были достигнуты. Потенциальные ингибиторы могут все еще присутствовать в очищенных нуклеиновых кислотах или уже вступили в силу. Существуют различные стратегии снижения воздействия ингибиторов. Выбор подходящей полимеразы может оказать существенное влияние на активность ингибитора. Другими проверенными методами снижения ингибирования ПЦР являются увеличение концентрации полимеразы или применение добавок, таких как BSA.
Ингибирование реакций ПЦР можно продемонстрировать с помощью внутреннего контроля качества процесса (IPC).
Необходимо позаботиться о том, чтобы удалить все реагенты и другие растворы в наборе для экстракции, такие как этанол, ЭДТА, ЦЕТАБ, LiCl, GuSCN, ДСН, изопропанол и фенол, из изолята нуклеиновой кислоты путем тщательной промывки. В зависимости от концентрации они могут активировать или ингибировать ПЦР.