Факторы помех в реакции ПЦР

Во время реакции ПЦР часто встречаются некоторые мешающие факторы.
Из -за очень высокой чувствительности ПЦР загрязнение считается одним из наиболее важных факторов, влияющих на результаты ПЦР и может привести к ложноположительным результатам.
Не менее важными являются различные источники, которые приводят к ложном негативным результатам. Если одна или несколько основных частей смеси ПЦР или самой реакции амплификации ингибируется или мешает диагностическому анализу. Это может привести к снижению эффективности и даже ложным отрицательным результатам.
В дополнение к ингибированию может возникнуть потеря целевой целевой кислоты -мишени из -за условий доставки и/или хранения до подготовки образца. В частности, высокие температуры или неадекватное хранение могут привести к повреждению клеток и нуклеиновых кислот. Клеточная и тканевая фиксация и парафиновое вкладывание являются хорошо известными причинами фрагментации ДНК и постоянной проблемы (см. Рисунки 1 и 2). В этих случаях даже оптимальная изоляция и очистка не помогут.

Рисунок 1 | Влияние иммобилизации на целостность ДНК
Электрофорез с агарозным гелем показал, что качество ДНК, выделенной из парафиновых срезов вскрытия, значительно варьировалось. ДНК различной средней длины фрагментов присутствовала в экстрактах в зависимости от метода фиксации. ДНК сохраняли только тогда, когда фиксировали в нативных замороженных образцах и в буферированном нейтральном формалине. Использование сильно кислотного фиксатора Буина или небефферы, содержащего муравьиную кислоту, привело к значительной потере ДНК. Оставшаяся фракция сильно фрагментирована.
Слева длина фрагментов экспрессируется в парах килобазы (KBP)

Рисунок 2 | Потеря целостности нуклеиновых мишеней
(а) 3'-5 'зазор на обеих прядях приведет к разрыву в целевой ДНК. Синтез ДНК все еще будет происходить на небольшом фрагменте. Однако, если на фрагменте ДНК отсутствует сайт отжига праймера, происходит только линейная амплификация. В наиболее благоприятном случае фрагменты могут повторно остановить друг друга, но урожайность будет небольшим и ниже уровней обнаружения.
(B) Потеря оснований, в основном из-за депо и образования димера тимидина, приводит к уменьшению количества H-связей и уменьшению TM. Во время удлиненной фазы потепления праймеры будут таять от матричной ДНК и не будут отжигать даже в менее строгих условиях.
(C) Прилегающие тиминовые основания образуют димер TT.
Другая распространенная проблема, которая часто возникает в молекулярной диагностике,-это менее оптимальное высвобождение нуклеиновых кислот-мишеней по сравнению с экстракцией фенол-хлороформ. В крайних случаях это может быть связано с ложными негативами. Много времени можно сохранить путем кипячения лизисом или ферментативного расщепления клеточного мусора, но этот метод часто приводит к низкой чувствительности ПЦР из -за недостаточного высвобождения нуклеиновой кислоты.

Ингибирование полимеразной активности во время амплификации

В целом, ингибирование используется в качестве концепции контейнера для описания всех факторов, которые приводят к неоптимальным результатам ПЦР. В строго биохимическом смысле ингибирование ограничивается активностью фермента, то есть оно снижает или предотвращает преобразование субстрата-продукта посредством взаимодействия с активным сайтом ДНК-полимеразы или ее кофактора (например, MG2+ для ДНК-полимеразы TAQ).
Компоненты в образце или в различных буферах и экстрактах, содержащих реагенты, могут непосредственно ингибировать фермент или улавливать его кофакторы (например, ЭДТА), тем самым инактивируя полимеразу и, в свою очередь, приводят к снижению или ложном отрицательно -отрицательному ПЦР.
Однако многие взаимодействия между компонентами реакции и целевыми нуклеиновыми кислотами также обозначены как «ингибиторы ПЦР». После того, как целостность клетки нарушается путем выделения и высвобождается нуклеиновая кислота, могут возникать взаимодействие между образцом и окружающим раствором и твердой фазой. Например, «мусорщики» могут связывать одно- или двухцепочечную ДНК посредством нековалентных взаимодействий и мешать выделению и очистке, уменьшая количество мишеней, которые в конечном итоге достигают реакционного сосуда ПЦР.
In general, PCR inhibitors are present in most body fluids and reagents used for clinical diagnostic tests (urea in urine, hemoglobin and heparin in blood), dietary supplements (organic components, glycogen, fat, Ca2+ ions) and components in the environment (phenols, heavy metals)

Более распространенные ингибиторы ПЦР могут быть обнаружены в бактериях и эукариотических клетках, нецелевой ДНК, ДНК-связывающих макромолекулах тканевых матриц и лабораторного оборудования, таких как перчатки и пластики. Очистка нуклеиновых кислот во время или после экстракции является предпочтительным методом удаления ингибиторов ПЦР.
Сегодня различное автоматизированное оборудование для добычи может заменить много ручных протоколов, но 100% восстановление и/или очищение целей никогда не достигнуто. Потенциальные ингибиторы все еще могут присутствовать в очищенных нуклеиновых кислотах или уже вступили в силу. Существуют различные стратегии, чтобы уменьшить влияние ингибиторов. Выбор соответствующей полимеразы может оказать существенное влияние на активность ингибитора. Другими проверенными методами уменьшения ингибирования ПЦР являются увеличение концентрации полимеразы или применение добавок, таких как BSA.
Ингибирование реакций ПЦР может быть продемонстрировано с помощью внутреннего контроля качества процесса (IPC).
Необходимо следить за удалением всех реагентов и других растворов в наборе для экстракции, таких как этанол, EDTA, CETAB, LICL, GUSCN, SDS, изопропанол и фенол, из изолята нуклеиновой кислоты с помощью тщательного этапа промывки. В зависимости от их концентрации, они могут активировать или ингибировать ПЦР.