Тестирование метилирования ДНК в сочетании со смартфонами для ранней диагностики опухолей и лейкемии с точностью 90,0%!

Ранняя диагностика рака на основе жидкостной биопсии — это новое направление в выявлении и диагностике рака, предложенное Национальным институтом рака США в последние годы с целью обнаружения рака на ранней стадии или даже предраковых поражений. Она широко используется в качестве нового биомаркера для ранней диагностики различных злокачественных новообразований, включая рак легких, опухоли желудочно-кишечного тракта, глиомы и гинекологические опухоли.

Появление платформ для идентификации биомаркеров метилирования (Methylscape) потенциально может значительно улучшить существующие методы ранней диагностики рака, позволяя выявлять пациентов на самой ранней стадии, поддающейся лечению.

Недавно исследователи разработали простую и прямую сенсорную платформу для обнаружения ландшафта метилирования на основе золотых наночастиц, модифицированных цистеамином (Cyst/AuNPs), в сочетании с биосенсором на базе смартфона, что позволяет проводить быструю раннюю диагностику широкого спектра опухолей. Ранняя диагностика лейкемии может быть проведена в течение 15 минут после выделения ДНК из образца крови с точностью 90,0%. Название статьи: Быстрое обнаружение раковой ДНК в крови человека с использованием AuNPs, покрытых цистеамином, и смартфона с поддержкой машинного обучения.

Рисунок 1. Простая и быстрая сенсорная платформа для скрининга рака с использованием компонентов Cyst/AuNPs может быть создана в два простых этапа.

Это показано на рисунке 1. Сначала для растворения фрагментов ДНК использовали водный раствор. Затем в полученный раствор добавляли Cyst/AuNPs. Нормальная и злокачественная ДНК имеют разные свойства метилирования, что приводит к образованию фрагментов ДНК с различными паттернами самосборки. Нормальная ДНК агрегирует слабо и в конечном итоге агрегирует Cyst/AuNPs, что приводит к красному сдвигу спектра Cyst/AuNPs, так что изменение цвета с красного на фиолетовый можно наблюдать невооруженным глазом. В отличие от этого, уникальный профиль метилирования раковой ДНК приводит к образованию более крупных кластеров фрагментов ДНК.

Изображения 96-луночных планшетов были получены с помощью камеры смартфона. ДНК раковых клеток измерялась с помощью смартфона, оснащенного функцией машинного обучения, в сравнении с методами, основанными на спектроскопии.

Скрининг рака в реальных образцах крови

Для расширения возможностей сенсорной платформы исследователи применили сенсор, который успешно различал нормальную и раковую ДНК в реальных образцах крови. Паттерны метилирования в CpG-сайтах эпигенетически регулируют экспрессию генов. Почти во всех типах рака наблюдаются чередующиеся изменения в метилировании ДНК и, следовательно, в экспрессии генов, способствующих развитию опухолей.

В качестве модели для других видов рака, связанных с метилированием ДНК, исследователи использовали образцы крови пациентов с лейкемией и здоровых контрольных лиц, чтобы изучить эффективность анализа ландшафта метилирования в дифференциации лейкемических опухолей. Этот биомаркер ландшафта метилирования не только превосходит существующие методы экспресс-скрининга лейкемии, но и демонстрирует возможность его применения для раннего выявления широкого спектра онкологических заболеваний с помощью этого простого и понятного анализа.

Был проведен анализ ДНК из образцов крови 31 пациента с лейкемией и 12 здоровых людей. Как показано на диаграмме размаха на рисунке 2а, относительное поглощение образцов раковых клеток (ΔA650/525) было ниже, чем у ДНК нормальных образцов. Это в основном связано с повышенной гидрофобностью, приводящей к плотной агрегации раковой ДНК, что предотвращало агрегацию Cyst/AuNPs. В результате эти наночастицы были полностью диспергированы во внешних слоях раковых агрегатов, что привело к различному распределению Cyst/AuNPs, адсорбированных на нормальных и раковых агрегатах ДНК. Затем были построены ROC-кривые путем изменения порогового значения от минимального значения ΔA650/525 до максимального значения.

Рисунок 2.(а) Относительные значения поглощения растворов кисты/AuNPs, показывающие присутствие нормальной (синий) и раковой (красный) ДНК в оптимизированных условиях.

(DA650/525) диаграмм размаха; (b) ROC-анализ и оценка диагностических тестов. (c) Матрица ошибок для диагностики здоровых и онкологических пациентов. (d) Чувствительность, специфичность, положительная прогностическая ценность (PPV), отрицательная прогностическая ценность (NPV) и точность разработанного метода.

Как показано на рисунке 2b, площадь под кривой ROC (AUC = 0,9274), полученная для разработанного сенсора, показала высокую чувствительность и специфичность. Как видно из диаграммы размаха, самая низкая точка, представляющая нормальную группу ДНК, плохо отделена от самой высокой точки, представляющей группу раковой ДНК; поэтому для дифференциации между нормальной и раковой группами использовалась логистическая регрессия. При наличии набора независимых переменных оценивается вероятность наступления события, например, принадлежности к раковой или нормальной группе. Зависимая переменная находится в диапазоне от 0 до 1. Следовательно, результатом является вероятность. Мы определили вероятность идентификации рака (P) на основе ΔA650/525 следующим образом.

где b=5,3533, w1=-6,965. Для классификации образцов вероятность менее 0,5 указывает на нормальный образец, а вероятность 0,5 или выше — на образец с раком. На рисунке 2c изображена матрица ошибок, полученная в результате перекрестной проверки методом «оставь все как есть», которая использовалась для проверки стабильности метода классификации. На рисунке 2d представлена ​​сводная информация об оценке диагностического теста метода, включая чувствительность, специфичность, положительную прогностическую ценность (PPV) и отрицательную прогностическую ценность (NPV).

Биосенсоры на основе смартфонов

Для дальнейшего упрощения тестирования образцов без использования спектрофотометров исследователи применили искусственный интеллект (ИИ) для интерпретации цвета раствора и различения нормальных и раковых клеток. С помощью компьютерного зрения цвет раствора Cyst/AuNPs был преобразован в нормальную ДНК (фиолетовый) или раковую ДНК (красный) на основе изображений 96-луночных планшетов, полученных с помощью камеры мобильного телефона. Искусственный интеллект может снизить затраты и улучшить доступность интерпретации цвета растворов наночастиц без использования каких-либо оптических устройств, таких как аксессуары для смартфонов. Наконец, для построения моделей были обучены две модели машинного обучения: случайный лес (RF) и метод опорных векторов (SVM). Обе модели, RF и SVM, правильно классифицировали образцы как положительные и отрицательные с точностью 90,0%. Это говорит о том, что использование искусственного интеллекта в биосенсорике на основе мобильных телефонов вполне возможно.

Рисунок 3. (а) Целевой класс раствора, зарегистрированный во время подготовки образца для этапа получения изображения. (б) Пример изображения, полученного на этапе получения изображения. (в) Интенсивность цвета раствора цисты/AuNPs в каждой лунке 96-луночного планшета, извлеченная из изображения (б).

Используя Cyst/AuNPs, исследователи успешно разработали простую сенсорную платформу для обнаружения ландшафта метилирования и сенсор, способный различать нормальную ДНК от раковой ДНК при использовании реальных образцов крови для скрининга лейкемии. Разработанный сенсор продемонстрировал, что ДНК, выделенная из реальных образцов крови, способна быстро и экономично обнаруживать небольшие количества раковой ДНК (3 нМ) у пациентов с лейкемией за 15 минут, показав точность 95,3%. Для дальнейшего упрощения тестирования образцов за счет исключения необходимости использования спектрофотометра, было применено машинное обучение для интерпретации цвета раствора и различения нормальных и раковых клеток с помощью фотографии, сделанной на мобильный телефон, при этом также была достигнута точность 90,0%.

Ссылка: DOI: 10.1039/d2ra05725e